[发明专利]一种犬乳腺癌细胞系、其建立方法及应用

说明书

本发明提供了一种犬乳腺癌细胞系、其建立及应用。该犬乳腺癌细胞系犬乳F17，保藏号为CGMCC No.22349，保藏日期为2021年05月26日；保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明提供的细胞系细胞呈多极形上皮形态特征，聚集成片状或团簇状，贴壁牢固，难消化分离。细胞接种成瘤率和自发性肺转移为100％，适用于犬乳腺癌的体内体外试验研究，为肿瘤发生发展机制研究、药物靶点研究、为药物治疗机制研究提供很好体外试验模型，具有重要的基础研究与临床应用价值。

技术领域

本发明属于微生物动物细胞系技术领域，具体涉及一种犬乳腺癌细胞系、其建立及应用。

背景技术

三阴性乳腺癌(TNBC)约占所有乳腺癌病例的15％，且不表达孕激素受体(PR)、雌激素受体(ER)和人表皮生长因子受体2(HER2)。因此，激素治疗对他们没有好处。TNBC患者的总生存率低于非TNBC患者。

犬乳腺癌(CMT)是未绝育的母犬中最常见的肿瘤之一。在临床中，CMT是仅次于皮肤肿瘤的第二大肿瘤。由于CMT与HBC具有相似的流行病学、组织学和临床特征，约50％的CMT病例为恶性。CMT已被用作研究人乳腺癌的良好模型。

目前对犬乳腺癌发病的分子机制尚不十分清楚，也无理想的治疗方案和药物。细胞系可以用于许多机制研究中，这为研究细胞侵袭及转移机制提供了好的平台。由于细胞来源的犬种不同，癌变基因也有差别，每个细胞系都是独特的存在，在癌症研究中都具有特殊性。目前已建立的犬乳腺癌细胞系十分有限，且犬三阴性乳腺癌细胞系还未见报道。且现有技术中制备犬乳腺癌细胞系存在不稳定、接种成瘤率不高等缺陷，因此亟需开发具有稳定性、能再现犬三阴性乳腺癌的临床特征的CMT细胞系。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一株犬乳腺癌细胞系并成功荷瘤小鼠，为研究犬乳腺癌发病机制和肿瘤转移分子机制提供细胞模型与研究工具。本发明还提供可以稳定使裸鼠成瘤的犬乳腺癌细胞系的建立方法。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

犬乳腺癌细胞系，命名为犬乳F17，保藏号为CGMCC No.22349，保藏日期为2021年05月26日；保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称为CGMCC，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

优选地，所述犬乳腺癌细胞系，能体外长期生长和稳定传代，具有下列生物学和遗传学特征：(1)细胞呈多极形上皮形态特征，聚集成片或团簇状，贴壁牢固，难消化分离接触性生长抑制丧失；(2)细胞为犬源，染色体数目为78条；(3)细胞接种成瘤率和自发性肺转移率为100％，能再现犬乳腺癌的临床特征。

优选地，临床特征为对数增殖期2-4天，免疫荧光Ki-67、SOX-2、DELTA-CATENIN、CLAUDIN-1为阳性；细胞冻存复苏后生长良好，能够连续传代。

如上所述犬乳腺癌细胞系的制备方法，其包括如下步骤：

(1)病例肿瘤分离：无菌切取临床犬乳腺肿瘤组织；

(2)瘤细胞原代培养：

肿瘤组织用含1％青霉素链霉素溶液的PBS研磨洗涤3次，然后，将肿瘤碎片收集，用胶原酶Ⅱ进行分解、离心、收集细胞，重悬于10％胎牛血清的DMEM/F12完全培养基，加1％青链霉素，细胞悬液在5％CO₂的细胞培养箱中培养；

(3)建立细胞系：

当细胞培养达到90％融合时，用PBS洗涤3次，然后用0.25％胰蛋白酶进行消化，将消化的细胞中提取二次培养物，换入新的培养液继续培养，每隔3d传代1次，分种率1:3，体外传代至50代后，生物学指标检测，验证。