[发明专利]一种核酸荧光染料及其制备和应用

说明书

本发明涉及荧光染料领域，特别是涉及一种新型的核酸荧光染料。本发明提供一种荧光染料，所述荧光染料的结构式如式I所示，其中，A^‑为氯离子、溴离子或碘离子。本发明对染料进行结构改造，提供另一种灵敏度高、稳定性好、原料易得、合成简单、序列偏好低、对PCR的抑制性小的化合物。

技术领域

本发明涉及荧光染料领域，特别是涉及一种新型的核酸荧光染料。

背景技术

荧光染料，指吸收某一波长的激发光后可以发射出特定波长的荧光物质。将荧光染料与不发射荧光的物质以某种方式结合，可以有选择性地将该物质的化学信号转变 为易被分析仪器测量到的荧光信号，从而实现对特定目标的荧光检测。该检测方法具 有灵敏性高，选择性好，可实现可视化以及生物体内实时、非破坏性在线监测等优势， 因此在生物分析领域得到广泛的应用。

核酸(如DNA及RNA)是生命体遗传信息的载体，由于其携带信息量大，并且 在细胞内含量相对稳定经常被作为目标分析物。目前，荧光检测是实现核酸分析的主 流方法。除通过共价偶联标记荧光染料外，非共价结合的“发光探针”(即核酸荧光染 料)是核酸定性定量分析最有利的手段。荧光染料可与核酸分子非共价结合，通过结 合前后自身荧光性质的巨大差异实现对靶标核酸分子的检测。这类荧光染料被广泛用 于各种状态下，如溶液、凝胶电泳、细胞内及环境中等的核酸分析。目前，市售的核 酸分析荧光染料较多，其中由美国Invitrogen公司销售的SYBR系列染料性能优异， 占据了国际上大部分的核酸染料市场。

在SYBR系列的染料中，应用最广的是SYBR Green I，因其具有低背景、低毒性 及超高的灵敏度已被广泛应用于DNA常规分析、DNA凝胶染色以及作为实时定量 PCR(qPCR)常规检测专用的核酸染料。然而，SYBR Green I仍有如下不足：

(1)首先，应用于qPCR的染料在PCR(105℃-55℃)和保存期间(-20℃-4℃) 应具有优异的化学稳定性。这就要求染料及其与核酸分子的复合物应具备一定的热稳 定性。此外，qPCR多使用Tris作为缓冲液，低温为碱性高温为微酸性。因此，要求 染料也具备较好的酸碱稳定性。然而，在上述条件下SYBR Green I并不具备良好的 稳定性；

(2)SYBR Green I对PCR过程具有浓度依赖的抑制效果，高浓度的染料使用会 抑制PCR过程；

(3)在核酸的常规分析中(包括qPCR以及凝胶电泳成像)，染料结合DNA的 序列应偏好低或没有。但据文献报道，SYBR Green I存在较明显的A-T序列偏好(参 见Zipper H,Brunner H,Bernhagen J,Vitzthum F(2004)Nucleic Acids Res 32:103e)；

(4)根据Invitrogen公司提供的使用说明，SYBR Green I在DMSO中可保持良 好的稳定性，在水溶液中稳定性差；

(5)另外，虽然SYBR Green I荧光性能优异，但根据逆合成分析，其合成极其 困难，并且收率极低(小于2％)。此外，由于其原料的价格较高致使SYBR Green I 价格昂贵(规格10000x，1mL的储备液官方售价高达1万元左右)，在实际应用中 成本居高不下。

尽管Invitrogen公司还售有另一种染料SYBR Safe，价格较低且诱变性低，可以作为SYBR Green I的替代品，但是这种替代的染料水溶性和灵敏度不够理想。

发明内容

针对现有技术中高效的核酸荧光染料(如SYBR Green I)不稳定、高浓度影响 PCR过程、合成困难等缺点，本发明对染料进行结构改造，提供另一种灵敏度高、稳 定性好、原料易得、合成简单、序列偏好低、对PCR的抑制性小的化合物。

本发明的技术方案：

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种荧光染料，所述荧光染料的结构式如式I所示：