[发明专利]一种脐带间充质干细胞外泌体及其提取方法与应用

权利要求书

1.一种脐带间充质干细胞外泌体的提取方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

一、脐带间充质干细胞的原代培养：

(1)将脐带置于含双抗的磷酸盐缓冲液中清洗，清洗后剪成小段，然后剖开脐带，剔除一条脐静脉、两条脐动脉，得到脐带华通胶组织；将所述脐带华通胶组织置于含双抗的磷酸盐缓冲液中清洗，然后继续裁剪，得到组织块；

(2)将所述组织块置于培养皿中静置培养；

(3)待细胞生长至80-90％融合时，用胰蛋白酶/EDTA消化液消化传代，得到脐带间充质干细胞；

二、脐带间充质干细胞的预处理：

(1)向所述脐带间充质干细胞中加入雷帕霉素进行预处理；

(2)经雷帕霉素预处理后再置于培养皿中进行培养，收集细胞培养上清液，用于外泌体提取；

三、脐带间充质干细胞外泌体的提取：

(1)将上述收集的细胞培养上清液置于离心机中低速离心，除去死亡细胞，离心后收集上清液；

(2)将低速离心后收集的上清液置于离心机中进行中速离心，除去细胞碎片，离心后收集上清液；

(3)将中速离心后收集的上清液置于再次离心机中进行高速离心，离心后收集沉淀；

(4)将所收集的沉淀加入缓冲液中进行重悬，得到脐带间充质干细胞外泌体。

2.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞外泌体的提取方法，其特征在于，一、脐带间充质干细胞的原代培养：步骤(1)将脐带置于含双抗的磷酸盐缓冲液中清洗1-3次，清洗后将脐带剪成2-3cm长的小段，然后纵行剖开脐带，剔除一条脐静脉、两条脐动脉，得到脐带华通胶组织；将所述脐带华通胶组织置于含双抗的磷酸盐缓冲液中清洗3-5次，然后用眼科剪剪成1mm³的组织块。

3.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞外泌体的提取方法，其特征在于，一、脐带间充质干细胞的原代培养：步骤(2)将所述组织块置于培养皿中，将培养皿置于5％CO₂、37℃的培养箱中倒立放置1-3小时，使组织块自然黏附在皿底上；然后加入DMEM+10％血清+1％双抗培养基，使组织块完全浸润在培养基中，正置放在培养箱中，静置培养。

4.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞外泌体的提取方法，其特征在于，二、脐带间充质干细胞的预处理：步骤(1)向所述脐带间充质干细胞中加入40-60nmol/L雷帕霉素预处理2-4小时。

5.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞外泌体的提取方法，其特征在于，三、脐带间充质干细胞外泌体的提取：步骤(1)中的离心速率为1500-2000g，离心20-30分钟，离心温度为4℃。

6.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞外泌体的提取方法，其特征在于，三、脐带间充质干细胞外泌体的提取：步骤(2)中的离心速率为9000-10000g，离心30-40分钟，离心温度为4℃。

7.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞外泌体的提取方法，其特征在于，三、脐带间充质干细胞外泌体的提取：步骤(3)中的离心速率为100000-120000g，离心50-60分钟，离心温度为4℃。

8.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞外泌体的提取方法，其特征在于，三、脐带间充质干细胞外泌体的提取：步骤(4)将所收集的沉淀加入DPBS缓冲液中进行重悬，得到脐带间充质干细胞外泌体。

9.一种脐带间充质干细胞外泌体，其特征在于，采用权利要求1-8任一项所述的提取方法提取得到。

10.一种脐带间充质干细胞外泌体的应用，其特征在于，将权利要求1-8任一项所述的提取方法提取得到的脐带间充质干细胞外泌体用于制备治疗老年性骨质疏松相关的骨缺损的药物。