[发明专利]一种海洋链霉菌磷脂酶D突变体及其重组表达菌株的制备方法

说明书

本发明公开了一种海洋链霉菌磷脂酶D突变体及其重组表达菌株的制备方法，所述的磷脂酶D突变体是在氨基酸序列为SEQ ID NO:1的亲本序列基础上发生如下突变：P343A；或Y383L；或P343A，Y383L；或P343A，Y383L，S380V，其对应的氨基酸序列为SEQIDNO:2，SEQID NO:3，SEQID NO:4，SEQID NO:5。相比于野生型，本发明突变体1的酶活力是野生型的1.3倍，突变体2的酶活是野生型的1.46倍，突变体3的酶活是野生型的3.9倍，突变体4的酶活是野生型的11.6倍。本发明获得的磷脂酶突变体活力得到显著提高。

技术领域

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体地说涉及利用分子生物学定点突变技术获得催化性能显著提高的磷脂酶D突变体及其重组表达制备方法和应用。

背景技术

磷脂是一种含有磷酸的混合脂类，是生物膜的基本成分和组成生命的必需物质。此外，磷脂由于其独特的化学结构和保健功能，已广泛应用于乳化剂、化妆品成分、医药配方和脂质体制剂。在工业中，天然磷脂主要是毛油精炼脱水和脱胶的副产品。近年来，人们对不同分子性质如电荷、极性、大小等的磷脂产生了极大的兴趣，以获得具有优良加工性能和突出生理药理功能的特殊功能磷脂。因此，对天然磷脂进行改性已成为实现磷脂副产物高价值利用的重要途径。

酶法修饰改性是制备功能性磷脂的一个重要方向。作为磷脂酶家族的重要成员，磷脂酶D(PLD)是合成和改造磷脂质的一类重要工具酶。磷脂酶D(PLD)(EC 3.1.4.4)可通过磷脂酰基转移作用(transphosphatidylation)催化磷脂质极性头部基团发生转移反应，从而合成为各种不同的稀有磷脂及系列功能性磷脂衍生物。PLD已被用于合成较少丰富的磷脂，如磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol，PG)，磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)，磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)和磷脂酰肌醇(phatidylglycerol，PI)。除此之外，通过PLD还合成了大量新型磷脂，其中包括磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)中的胆碱被脂族醇、糖类，核苷、芳香醇或n-杂环醇所取代。尽管PLD可以用于合成大量磷脂，磷脂酶D来源单一、酶活力低下、制备难度大、成本高是当前制约该类酶开发的技术瓶颈，其中酶活力低下成为主要的制约因素，离工业化应用的需求还有很大的差距。利用蛋白质工程对酶分子进行改造成为解决该问题的主要方案，如中国发明专利201610402557.7中利用重组DNA技术对野生型磷脂酶D基因进行定点突变，得到活力较高的磷脂酶D基因。重组表达后，检测高活力磷脂酶D的比酶活较野生型磷脂酶D提高38-140％。酶分子体外定向进化属于蛋白质的非理性设计，属于蛋白质工程的范畴。通常手段是利用分子生物学手段在分子水平创造出分子的多样性，结合灵敏、高通量的筛选技术，

从而能够在短时间内得到理想的突变体。通过合理设计改造酶基因可以提高PLDs的催化性能。

发明内容

为了克服现有技术存在的缺陷，本发明提供一种高活力磷脂酶D。

SEQ ID No.1