[发明专利]一种枯草芽孢杆菌的MNP标记位点、引物组合物及其应用

说明书

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用，所述MNP标记位点是指在枯草芽孢杆菌基因组上筛选的区分于其他物种且在物种内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括MNP‑1～MNP‑12的标记位点；所述引物如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.24所示。所述MNP标记位点能特异的鉴定枯草芽孢杆菌并精细的区分不同的亚型；所述引物互不干扰，综合多重扩增和测序技术，可一次性对多样本的所有标记位点进行序列分析，具有高通量、多靶点、高灵敏和检测低频变异的优势，可应用于大规模样本的枯草芽孢杆菌的鉴定和遗传变异检测，对枯草芽孢杆菌的科研、退化监测具有重要意义。

技术领域

本发明实施例涉及生物技术领域，特别涉及一种枯草芽孢杆菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，是芽孢杆菌属的一种，革兰氏阳性菌，广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖而得名。枯草芽孢杆菌作为一种安全和极具开发潜力的微生物菌种，现已广泛应用于工业、农业、医药、卫生、食品、畜牧业、水产及科研诸多领域。然而在实际应用过程中，菌种常发生变异、退化、繁殖力下降、抗性效应减弱甚至丧失等现象，特别是在菌种经历多次传代以后，这种退化现象更为严重，极大地影响了生产或科研工作的正常进行，因此，建立一种快速、准确的枯草芽孢杆菌的变异检测方法具有重要意义。

经典的枯草芽孢杆菌检测方法，包括分离培养、PCR技术、全基因组和宏基因组测序等，在时长、操作复杂度、检测通量、检测变异的准确性和灵敏度、成本等方面存在一个或多个局限。融合超多重PCR扩增和高通量测序的靶向分子标记检测技术，可以在低微生物含量的样本中靶向的富集目标微生物，避免了全基因组和宏基因组测序带来的大量数据浪费和背景噪音，具有样本需要量少、诊断结果精确，节约数据量、检测低频变异的优势。

现有的靶向检测技术检测的分子标记主要包括SNP和SSR标记。SSR标记是公认的多态性最高的标记，但在微生物中数量少；SNP标记数量巨大，分布密集，是二态性标记，单个SNP标记的多态性不足以捕获微生物种群中潜在的等位基因多样性。

因此，开发病原微生物枯草芽孢杆菌的高多态性的新型分子标记及其检测技术，成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明目的是提供一种枯草芽孢杆菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用，可以对枯草芽孢杆菌进行定性鉴定和变异检测，具有多靶标、高通量、高灵敏和精细分型的效果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

在本发明的第一方面，提供了一种枯草芽孢杆菌的MNP标记位点，所述MNP标记位点为在枯草芽孢杆菌基因组上筛选的物种特异的、且在物种内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括AL009126基因组上MNP-1～MNP-12的标记位点。

上述技术方案中，MNP-1～MNP-12的标记位点具体如说明书表1所示，表1中标注的所述MNP标记的起始和终止位置是基于AL009126序列确定的。

在本发明的第二方面，提供了一种用于检测所述MNP标记位点的多重PCR引物组合物，所述多重PCR引物组合物包括12对引物，所述12对引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.24所示。

上述技术方案中，每个MNP标记位点的引物包括上引物和下引物，具体如说明书表1所示。

在本发明的第三方面，提供了一种用于检测所述枯草芽孢杆菌MNP标记位点的检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组合物。

进一步地，所述试剂盒还包括多重PCR预混液。

在本发明的第四方面，提供了所述的枯草芽孢杆菌的MNP标记位点或者所述的多重PCR引物组合物或者所述的检测试剂盒在枯草芽孢杆菌检测中的应用。