[发明专利]基于衣壳蛋白p72建立的非洲猪瘟病毒抗体检测试纸及制备方法

权利要求书

1.一种基于衣壳蛋白p72建立的非洲猪瘟病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸，其特征在于，包括支撑底板，在支撑底板上按顺序依次固定有样品垫、金标蛋白垫、层析检测膜和吸水垫；其中金标蛋白垫由玻璃纤维棉包被，固定有胶体金标记的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白；层析检测膜为硝酸纤维素膜，其上设置有检测线和质控线，其中检测线上固定有葡萄球菌蛋白A，质控线上固定有抗非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。

2.如权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述胶体金标记的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的制备方法为：取1mL胶体金溶液，加入2μL 0.2mol/L K₂CO₃及120μL的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白，室温反应5-10min后，加入3％酪蛋白溶液100μL，室温封闭10min，以12 000r/min的速度离心25min，弃上清，加入100μL的含1.2wt％BSA、0.05wt％叠氮钠的PBS缓冲液重悬，即得。

3.如权利要求2所述的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述胶体金溶液的制备方法为：取100mL超纯水，加入1mL 10g/L的氯金酸煮沸；在加热搅拌状态下迅速加入新鲜配制的1.6mL 10g/L的柠檬酸三钠溶液，观察颜色由无色→蓝色→深红色→亮红色，直至颜色不再发生变化，待溶液冷却至室温，用超纯水定容至100mL，4℃避光保存。

4.如权利要求2所述的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的制备方法为：

根据GenBank:MK333180.1获取编码p72蛋白的基因序列B646L和其伴侣蛋白基因序列B602L，分别在蛋白N段添加His和Flag标签，构建pCMV载体，进行密码子优化，交由上海生工生物工程有限公司合成，得到两个质粒，分别命名为pCMV-B646L和pCMV-B602L；

将两个质粒共转染到HEK293F细胞，HEK293F细胞的密度为2.0×10⁶cells/mL，培养72h后以100g/min的转速离心10min收取细胞；弃去培养液后，加入400mM NaCl和20mM HEPESBuffer重悬细胞沉淀，进行超声破碎，超声3s间隔4s，共超声20min；然后以12000rpm/min的转速离心15min；

收集离心后的上清，经0.45um滤膜过滤后，使用Ni-NAT亲和层析柱，经100mM的咪唑洗去杂质，300mM的咪唑洗脱纯化后，再经超滤浓缩及凝胶过滤层析纯化处理后，分离得到非洲猪瘟病毒p72重组蛋白，分装后于-80℃保存备用。

5.如权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述抗非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的多克隆抗体制备方法为：

以权利要求4制备的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白为免疫原免疫健康新西兰兔，首次免疫以弗氏完全佐剂乳化抗原，以200μg/只的剂量皮下多点注射；每次加强免疫间隔3周，以弗氏不完全佐剂乳化抗原进行注射；最后一次加强免疫2周后，将非洲猪瘟病毒p72重组蛋白以1.6μg/mL的浓度，每孔50μL的用量包被酶联免疫吸附板，用ELISA方法测定免疫血清抗体效价；当效价达到1:6.4×10⁴时，采集高免兔全血，37℃放置2h后，于4℃分离血清，以3000rpm/min的速度离心10min，收取上清；

取1mL上清，将上清逐滴加入10mL含18％(wt)的无水硫酸钠溶液中，于37℃温箱静置2h，以10000r/min的速度离心20min，弃上清；取沉淀用1mL的超纯水重悬，用生理盐水进行透析，换液3-4次，即得，分装后冻存，备用。