[发明专利]新型荧光二氧化硅纳米球-炭疽抗体缀合物及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种新型荧光二氧化硅纳米球‑炭疽抗体缀合物，为以炭疽为抗原的荧光二氧化硅纳米球标记的荧光免疫层析试纸条结构，该试纸条为以荧光二氧化硅纳米球为信号物的三明治型夹心免疫传感器，该试纸条包括硝基纤维素NC膜的检测线固载的炭疽包被抗体、荧光二氧化硅纳米球标记的炭疽标记抗体、以及通过抗原‑抗体间相互作用与两者分别相连的炭疽保护性抗原PA。并公开了其制备方法，以及其在制备炭疽检测试剂盒上的应用。本发明可用于高灵敏度检测炭疽PA，能够检测PA的可视化灵敏度高达100pg/mL。

技术领域

本发明涉及炭疽检测领域，尤其涉及一种新型荧光二氧化硅纳米球-炭疽抗体缀合物及其制备方法，以及其在制备炭疽检测试剂盒上的应用。

背景技术

炭疽(anthrax)是炭疽杆菌(Bacillus anthracis)引起的人畜共患的急性传染病。病死率较高。炭疽杆菌是革兰阳性的粗大杆菌。炭疽杆菌的抗原组成有荚膜抗原、菌体抗原、保护性抗原及芽胞抗原四种。保护性抗原(PA)具有很强的免疫原性。已证实对PA的免疫反应对于预防炭疽芽孢杆菌至关重要。快速准确的检测炭疽杆菌对于制定疾病预防、治疗和控制方案具有重大意义。

免疫层析试纸条由于其即时检测，方法简单，检测时间段，成本低等优点而成为倍受青睐的检测手段。随着免疫层析技术的发展，越来越多的物质被用作试纸条的信号物，以提高足够的灵敏度。在信号物中，从比色信号物(例如Au、碳材料和染料)发展为非比色信号物(例如荧光染料、量子点QD、上转换磷光体、磁性和表面增强拉曼散射SERS粒子)，从较小的纳米信号物发展为其不同的形态(如纳米棒、纳米壳和纳米立方体)或二级结构(如多聚体金信号物、荧光纳米球、磁性纳米球)。荧光纳米球一般是指球体表面标有荧光材料(包括表面覆盖)或球体内部结构含有荧光材料(如嵌入或聚合)，可以通过外部能量激发荧光。荧光染料、上转换荧光材料和半导体是常用的荧光材料。这些纳米珠的制备通常效率低下、耗时、昂贵或需要使用危险化学品。

发明内容

发明目的：针对现有技术的不足与缺陷，本发明提供一种新型荧光二氧化硅纳米球-炭疽抗体缀合物及其制备方法和应用，用于高灵敏度检测炭疽PA，能够检测PA的可视化灵敏度高达100pg/mL。

技术方案：本发明的新型荧光二氧化硅纳米球-炭疽抗体缀合物，为以炭疽为抗原的荧光二氧化硅纳米球标记的荧光免疫层析试纸条结构，该试纸条为以荧光二氧化硅纳米球为信号物的三明治型夹心免疫传感器，该试纸条包括NC膜的T线固载的炭疽包被抗体、荧光二氧化硅纳米球标记的炭疽标记抗体、以及通过抗原-抗体间相互作用与两者分别相连的炭疽保护性抗原PA。

其中，该缀合物的制备方法，包括下述步骤：

1)制备NC膜的T线上固载炭疽包被抗体的试纸条；

2)制备荧光二氧化硅纳米球标记的炭疽标记抗体；

3)将固载炭疽包被抗体的试纸条T线和新型荧光二氧化硅纳米球标记的炭疽标记抗体与炭疽PA抗原连接。

其中，所述的步骤1)中，采用黑色底板、样品垫、包被有检测T线和对照C线的NC膜、吸水垫组合，底板上的NC膜的一端粘贴吸水垫，NC膜与吸水垫之间相互重叠1mm～2mm，在NC膜的另一端粘贴样品垫；所述NC膜T线上固载有炭疽包被抗体；所述NC膜C线上固载有羊抗鼠多克隆IgG抗体；所述T线的炭疽包被抗体的浓度为0.04mg/cm²～0.07mg/cm²；所述C线的IgG抗体的浓度为0.04mg/cm²～0.07mg/cm²。

其中，所述的步骤2)中，采用APTES将荧光二氧化硅纳米球氨基化，采用丁二酸苷将氨基封端的荧光二氧化硅纳米球羧基化，采用EDC将荧光二氧化硅纳米球表面的羧基活化后与炭疽标记抗体反应，制得新型荧光二氧化硅纳米球标记的炭疽标记抗体。

其中，所述的步骤2)中，荧光二氧化硅纳米球的制备方法包括下述步骤：