[发明专利]一种扩散型3龄松材线虫的鉴定方法

说明书

本发明涉及线虫鉴定技术领域，具体涉及一种扩散型3龄松材线虫的鉴定方法。本发明提供的扩散型3龄松材线虫的鉴定方法包括采用形态学和分子生物学鉴定扩散型3龄松材线虫。本发明针对扩散型3龄松材线虫提供合理适宜的分类鉴定标准，本发明可以实现将扩散型3龄松材线虫虫态与松材线虫其它时期形态进行形态学分类，细化了松材线虫不同时期的形态学的分类。

技术领域

本发明涉及线虫检测技术领域，具体涉及一种扩散型3龄松材线虫的鉴定方法。

背景技术

松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)属于线虫动物门、线虫纲、滑刃目、滑刃科、伞滑刃属，可引起松树枯萎病(Pine Wilt Disease)。松树枯萎病是最具危险性的森林病害之一。随着气温降低，松树体内温度随之降低，新陈代谢速率开始减慢，同时体内的松材线虫由繁殖型幼虫向扩散型3龄幼虫转化。扩散型3龄松材线虫是松材线虫抵抗不利环境形成的虫态，也是松材线虫生活史的幼虫阶段之一。

扩散型3龄松材线虫的生命力顽强，在极端环境条件下可进行休眠，休眠的意义在于抵抗低温等极端环境，延长生命周期。多种线虫在渗透压胁迫条件下可进入脱水休眠状态，有线虫休眠超过3万年的记录。脱水休眠过程是指线虫通过逐渐脱水进入隐生状态，此状态运动停止，新陈代谢降低，生命周期处于暂停阶段。在适宜条件下脱水休眠的线虫可通过复水重新恢复活力。

发明内容

现有技术在进行扩散型3龄松材线虫的检测时，由于没有明确的形态学特征，存在鉴定不准确的缺陷。松材线虫已有的形态学鉴定标准主要是依据，体内是否含有大量的脂肪粒来进行判断的。这样的判断方法，缺点在于：松材线虫的其他虫态时期，体内也会含有大量的脂肪粒，仅依据这一个标准，会出现误判，不能准确区分松材线虫不同龄期的虫态。

获得松材线虫不同龄期虫态间的形态学特征的难点在于：

(1)适宜于显微观察的松材线虫不同龄期虫态不易获取，如扩散型3龄幼虫仅在低温休眠状态下可以获得；

(2)由于扩散型3龄松材线虫的形态学特征并不明确，即使出现了一些形态学特征，也不能准确判断这个形态学特征是扩散型3龄幼虫，而不是松材线虫的其他虫态时期。

本发明的目的是提供一种快速准确鉴定松材3龄线虫的方法，具体方案如下。

第一方面，本发明提供一种扩散型3龄松材线虫的鉴定方法，将获得的松材线虫放置于显微镜下，鉴定标准为：无生殖器官构造且头部顶端有溢缩的松材线虫，为扩散型3龄松材线虫。

在本发明提供的鉴定方法中，所述鉴定标准还可以为：无生殖器官构造且尾部钝圆，较宽，无尾尖突的松材线虫，为扩散型3龄松材线虫。

在本发明提供的鉴定方法中，所述鉴定标准还可以为：无生殖器官构造且尾部成“指形”的松材线虫为扩散型3龄松材线虫。

本发明提供的鉴定方法中，所述扩散型3龄松材线虫热处理后呈“(”形。

本发明提供的鉴定方法中，在对松材线虫进行显微镜观察前，使用如SEQ IDNo.1-2所示的引物，以病原线虫DNA为模板进行PCR扩增，确保所述病原线虫为松材线虫。

本发明提供的鉴定方法中，所述松材线虫为松材线虫Bursaphelenchusxylophilus。

根据本领域技术人员的理解，本发明还请求保护，上述的鉴定方法，在提高扩散型3龄松材线虫鉴定准确率中的应用。上述的鉴定方法，在松材线虫病防治策略制定中的应用。上述的鉴定方法，在松材线虫不同龄期虫态间的形态学分类中的应用。

本发明还提供一种获取扩散型3龄幼虫形态学特征的方法，包括：

(1)收集在低温环境下的松材线虫群体，将同一松木中的松材线虫群体分为第一群体和第二群体，记录第一群体的形态学特征；