[发明专利]一种检测硝基还原酶的双光子荧光探针及其制备方法和用途

说明书

本发明公开了一种检测硝基还原酶的双光子荧光探针及其制备方法和用途，其中检测硝基还原酶的荧光探针的结构如下：本发明检测硝基还原酶的双光子荧光探针，在体外实验中表现出对硝基还原酶的良好响应性。细胞毒性测试表明该荧光探针的生物毒性较低，共聚焦荧光显微成像实验表明该荧光探针可以检测出常氧/缺氧时HeLa细胞线粒体内的硝基还原酶含量变化，可用于判断细胞线粒体内是否缺氧。

技术领域

本发明涉及一种检测硝基还原酶的双光子荧光探针及其制备方法和用途，以实现双光子共聚焦成像检测缺氧和常氧下细胞线粒体内硝基还原酶的变化，具有高选择性、高灵敏度、低生物毒性的优点。

背景技术

缺氧是一种组织供氧不足的情况，大量的实验表明，缺氧可以由肿瘤造成，一是肿瘤通过减少血液的供应从而减少了氧气的运输，二是肿瘤细胞的耗氧量较大，从而导致缺氧。临床研究表明，肿瘤的缺氧情况与其生长进展有着十分密切的关系，缺氧会使肿瘤更加容易发生转移和恶化，因此开发一种检测细胞缺氧的新方法对临床研究十分有意义。缺氧会使得生物体内发生很多还原反应，导致大量还原型酶的积累包括醛氧化酶、酯酰脱氢酶和硝基还原酶(nitroreductase，NTR)。硝基还原酶在近些年被大量的研究，是理想的缺氧标记物，具有很高的选择性和代表性。在缺氧的情况下，硝基还原酶可以在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的存在下，将NADH作为电子供体还原含有硝基的化合物，并且硝基还原酶含量会异常地增加，所以硝基还原酶与生物体内缺氧的水平有着密切的关系。

荧光探针具有反应迅速，高灵敏性，高特异性和优良的生物相容性在硝基还原酶的检测中得到了广泛的应用。近些年来，许多探针在检测硝基还原酶方面取得了重大进展。但是这类探针在细胞成像方面的应用较少，或者无法定位线粒体，且不具有双光子性质。双光子共聚焦成像由于能够提供更深的穿透力和高分辨成像等优势已成为一种在亚细胞水平上对分析物进行可视化监测的有效方法。因此设计出一种双光子荧光探针，实现活细胞线粒体内硝基还原酶的灵敏检测显得十分重要。

发明内容

本发明旨在提供一种检测硝基还原酶的双光子荧光探针及其制备方法和用途，所要解决的技术问题是通过分子设计得到一种可以特异性识别硝基还原酶的有机小分子结构，以实现通过双光子共聚焦荧光成像监测活细胞线粒体内硝基还原酶含量的变化，具有选择性高、灵敏度高、光稳定性好等优点，细胞毒性测试表明本发明荧光探针的细胞相容性良好。

本发明双光子荧光探针，简记为NO₂-1，其结构式如下所示：

本发明双光子荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：将Compound1(0.5g，1.17mmol)和对羟基苯甲醛(1.25g，10.23mmol)放入史莱克瓶中，在无氧的条件下加入乙醇(10mL)和哌啶(2滴)，60℃加热12h，等到反应完全后，冷却至室温，用石油醚醚抽滤后，真空干燥，得到灰红色固体OH-1，0.4g，产率59.25％。

步骤2：在45℃下，将OH-1(1g，2.53mmol)，Cs₂CO₃(1.5g，3.06mmol)和4-硝基苄基溴苯(0.82g，3.8mmol)放入到史莱克瓶中，并在N₂氛围下，滴加10ml的DMF，在45℃下搅拌4h，冷却蒸掉溶剂，用石油醚抽滤，得到的固体通过色谱柱(二氯甲烷:石油醚＝2:1)的方法提纯，减压蒸馏后真空干燥，得到淡黄色粉末NO₂-1，0.6g，产率64％。

本发明双光子荧光探针的合成路线如下所示：

本发明双光子荧光探针的用途，是用于制备检测活细胞线粒体内的硝基还原酶变化时的检测试剂。检测方法包括如下：