[发明专利]一种线粒体靶向的pH和粘度双通道检测荧光探针及其制备方法和用途

说明书

本发明公开了一种线粒体靶向的pH和粘度双通道检测荧光探针及其制备方法和用途，其中线粒体靶向的pH和粘度双通道检测荧光探针的结构如下：本发明线粒体靶向的pH和粘度双通道检测荧光探针，可以在体外对pH和粘度产生无干扰的双色荧光响应。细胞毒性测试表明该荧光探针的生物相容性良好，共聚焦荧光显微成像实验表明该荧光探针对HeLa细胞光稳定性好，可以有效定位细胞中的线粒体(定位系数为0.92)，适用于细胞内的共聚焦荧光成像和双通道检测。

技术领域

本发明涉及一种线粒体靶向的pH和粘度双通道检测荧光探针及其制备方法和用途，以实现在溶液中和细胞中线粒体靶向的pH和粘度双通道检测荧光成像，具有选择性专一、检测高效、生物相容性良好的优点。

背景技术

线粒体是真核细胞母系遗传的细胞质细胞器，是重要的生物能合成工厂。线粒体在细胞新陈代谢，器官、组织以及整个生命体内包括Ca²⁺平衡的调控、清除多余或者破损的细胞器和触发细胞死亡等方面都起着至关重要的作用。因此，细胞的存活需要维持正常的线粒体水平。线粒体缺陷或功能障碍与一些心血管和神经性疾病等有关。而且线粒体的微环境与其功能关系紧密，尤其是pH值和粘度直接影响其生化过程。例如线粒体表现出一种略碱性基质，穿过内膜的质子动力能驱动ATP合成、离子及代谢物吸收到基质中去。由此可见，线粒体动态变化和微环境的检测对线粒体生物学及相关疾病的研究具有重要意义。

到目前为止，已报道的pH和粘度测定方法包括核磁共振法(NMR)、吸收光谱法、表面增强拉曼散射法(SERS)、水凝胶等。而基于pH荧光探针的荧光成像方法因能排除其他信号分子的干扰，对pH具有特异性响应、灵敏度高和实时性等优点而备受关注。细胞器粘度是一种重要的微环境参数，它通过影响活细胞内生物分子和化学信号的相互作用和传递而发挥生物学功能。

近年来，荧光成像的方法已经被广泛应用于监测生物过程，但对细胞线粒体特异性成像还是非常少，特别是兼具粘度和pH双重检测功能，因此开发细胞pH和粘度双通道检测荧光探针是非常迫切和重要的。

发明内容

本发明旨在提供一种线粒体靶向的pH和粘度双通道检测荧光探针及其制备方法和用途，所要解决的技术问题是通过分子设计得到一种可以特异性靶向线粒体，且可以分别无干扰响应pH和粘度的有机小分子结构，可通过共聚焦荧光成像实时监测活细胞线粒体内pH和粘度的变化，具有选择性高、灵敏度高、光稳定性好等优点，以实现细胞线粒体的荧光成像。细胞毒性测试表明本发明pH和粘度检测荧光探针的细胞相容性良好。

本发明线粒体靶向的pH和粘度双通道检测荧光探针，简记为CMPV，以香豆素为母体，其结构式如下：

本发明线粒体靶向的pH和粘度双通道检测荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：将3g(18.5mmol)7-羟基香豆素和5mL乙酸酐溶解在25mL二氯甲烷中，25℃活化半小时再加入0.1mL哌啶继续反应1小时；反应结束后，加冰水洗涤，抽滤得到中间体1，为白色固体,3.02g，产率80％。

步骤2：在冰水浴条件下，在圆底烧瓶中加入磁子，20mL三氟乙酸(TFA)和3g(21.4mmol)六亚甲基四胺(HMTA)，保持冰水浴搅拌半小时，室温下继续反应1小时，将2g(9.8mmol)中间体1溶解在5mL TFA中然后缓慢加入体系中，80℃回流(rf)反应48h；反应结束后，柱色谱法提纯得淡黄色固体中间体2(洗脱液为石油醚：乙酸乙酯＝8：1，v/v)，1.21g，产率65％。

步骤3：1.00g(5.2mmol)中间体2，1.5g(5.2mmol)苯并噻唑碘甲烷鎓化物，10mL无水乙醇作为溶剂，再滴加3滴哌啶，90℃回流反应14小时；反应结束后用丙酮洗，过滤得到灰绿色色固体目标产物CMPV。

本发明线粒体靶向的pH和粘度双通道检测荧光探针CMPV的合成过程如下：