[发明专利]一种VWF前肽表达载体及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种VWF前肽表达载体及其制备方法和应用，包括VWF信号肽和VWF结构域D1D2区的编码序列以及终止密码子。基于VWF前肽参与VWF多聚体组装的作用机制，本发明的VWF前肽表达载体可以仅仅通过引入正常的VWF前肽，恢复部分先天性VWF多聚体形成障碍，为通过“蛋白质结构编辑”在蛋白水平上纠正先天性缺陷的基因治疗策略铺平了道路。

技术领域

本发明属于血管性血友病领域，特别涉及一种VWF前肽表达载体及其制备方法和应用。

背景技术

血管性血友病因子(VWF)是出凝血系统中非常重要的高分子量糖蛋白，其主要功能是介导血小板粘附于受损的内皮下暴露的胶原，并保护凝血因子VIII不被过快降解。这些功能依赖于VWF亚基多结构域结构中许多配体的结合位点：D1-D2-D'-D3-A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK。此外，VWF单体可首尾相连形成多聚体，且只有高分子量VWF多聚体才具备相应的生理功能。VWF多聚体形成缺陷会导致2A型血管性血友病。位于VWF前肽区(D1D2区)、D3区、CK区的VWF基因突变可影响VWF多聚体组装，使其不能形成高分子量多聚体，从而导致VWF功能缺失和出血倾向。像其他遗传性出血性疾病一样，基因治疗也是治愈血管性血友病(VWD)的唯一希望。通常基因治疗的方法是把完整的正常VWF基因通过病毒载体输入人体来纠正遗传缺陷，然而由于VWF分子特别大，是人体中最大的基因之一，病毒载体包装制备难度很大，几乎无法实现。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种VWF前肽表达载体及其制备方法和应用，克服了现有技术需要把完整的正常基因通过病毒载体输入人体来纠正遗传缺陷的缺点。

本发明基于VWF多聚体组装机制，提供了一种VWF前肽表达载体，包括VWF信号肽和VWF结构域D1D2的编码序列以及终止密码子；所述编码序列如SEQ NO.1所示。

所述载体包括pCIneo、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒等。

本发明还提供了一种VWF前肽表达载体的制备方法，包括：

将全长野生型人VWF cDNA克隆到表达载体pCIneo中，构建了VWF表达载体pCIneoVWFWT；基于pCIneoVWFWT进行定点突变构建突变体表达载体，并通过直接测序进行确认；根据VWF信号肽和VWF结构域D1D2的编码序列，在pCIneoVWFWT上插入一个位点定向突变的终止密码子，得到VWF前肽表达载体pCIneoVWFpp。

用于制备基因治疗药物。

有益效果

通过本发明的VWF前肽表达载体仅仅引入野生型VWF前肽，便可恢复部分先天性VWF多聚体形成障碍，为通过“蛋白质结构编辑”在蛋白水平上纠正先天性缺陷的基因治疗策略铺平了道路。

附图说明