[发明专利]宿主细胞针对新冠病毒侵入的防御分子筛选评价方法

说明书

本申请提供了一种宿主细胞针对新冠病毒侵入的防御分子筛选评价方法，其中使用干扰素刺激基因ISG稳定诱导过表达细胞系和基于HIV骨架的表达新冠病毒包膜蛋白突变体的假病毒来进行评价。本申请的方法操作安全，检测结果稳定可靠，有助于探索病毒与防御分子的相互作用关系，阐明宿主抵抗病毒感染的防御机制，为疫病的防治提供新靶标。

技术领域

本申请涉及分子生物学领域和传染病病理学领域，具体的，本申请提供了一种宿主细胞针对新冠病毒侵入的防御分子筛选评价方法。

背景技术

近几十年来，在探究宿主-病毒相互作用的研究中，随着功能缺失的遗传筛选技术的广泛应用，可实现在多个模型系统中研究不同基因的功能，但该技术并不适用于哺乳动物细胞。之后，RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术的开发及应用为病毒-宿主相互作用研究带来了新的技术革命，但该技术存在着脱靶率高、基因沉默不完全等缺点，因此不太适用于解释表型变化。近年来，单倍体胚胎干细胞的研发取得重大进展，利用单倍体技术已筛选到了多种调控病毒复制相关的宿主因子。但单倍体胚胎干细胞随着传代次数的增加易发生二倍体化，因此该技术在哺乳动物体外基因筛选中的应用受到了一定限制。几年前兴起的CRISPR/Cas9技术因高切除率及低脱靶率等优势引领了功能基因筛选的潮流，被广泛应用在发掘病毒复制相关宿主分子的研究中，但该技术仅适用于活病毒防御分子的筛选和鉴定，因此，对于高致病性病原体的研究非常受限。

筛选SARS-CoV-2感染宿主后诱导机体产生的干扰素刺激基因等防御分子以及评价其防御功能水平，最直接的方法是使用活病毒感染靶细胞，观察细胞病变效应，计算空斑形成数量。当存在某种防御分子高表达时，细胞病变效应形成不明显。相反，细胞病变严重，空斑形成数量较多；最后，通过高通量基因组测序技术分析造成细胞病变效应差异的两种细胞内不同基因表达情况或者通过RNAseq测序技术分析细胞内不同蛋白表达水平，从而初步筛选出宿主细胞抵抗新冠病毒侵入的候选防御分子。但是由于新冠活病毒的操作必须在BSL-3实验室中进行，受实验条件和病毒来源等因素的限制，因此，上述基于活病毒感染的筛选防御分子的过程既不能满足科研人员研究需求，更不能及时筛选出防御分子为疫情防控以及疫苗的研发提供有效靶点。

发明内容

为了解决活病毒研究受限这一问题，本研究建立了干扰素刺激基因ISG稳定诱导过表达细胞系以及结合HIV/Luc(NL4-3 R-E-Luc)报告基因载体包装假病毒颗粒技术，并依据假病毒颗粒多用于包膜病毒侵入阶段的机制进行新冠病毒防御分子研究，旨在筛选和评价宿主细胞抵抗新冠病毒侵入的防御分子以及评估其防御功能。本研究建立的干扰素刺激基因ISG稳定诱导过表达细胞系，可以在添加四环素诱导剂的条件下有效稳定表达该干扰素刺激基因蛋白分子，并在瞬时转染hACE2受体后，为本研究提供成熟的感染靶细胞模型。本研究建立的基于HIV/Luc报告载体的假病毒检测系统，利用含报告基因的慢病毒载体成功地包装出新冠病毒等多种假病毒颗粒，为本研究提供了有效病毒试验体系。此慢病毒载体的复制关键基因Env及Vpr已被突变，因此包装出复制缺陷型假病毒颗粒。而Nef区插入的荧光素酶基因(Luc)的表达可以通过荧光测定仪精确地检测,实现病毒的定量检测，反映假病毒的感染能力。该假病毒检测系统不仅操作安全，检测结果稳定可靠而且可以有效地评估候选蛋白分子抵抗新冠病毒侵入的功能水平。通过假病毒感染荧光检测系统和ISG诱导过表达细胞系，在靶细胞被瞬时转染hACE2受体构建成熟的细胞感染模型之后，感染SARS-CoV-2假病毒颗粒，通过荧光报告基因检测系统，我们筛选出了干扰素刺激基因表达的蛋白分子LY6E是抑制SARS-CoV-2病毒入侵环节的重要防御分子，同时，有效地评估了LY6E抵抗SARS-CoV-2感染的功能水平。

一方面，本申请提供了宿主细胞针对新冠病毒侵入的防御分子筛选评价方法，其中使用干扰素刺激基因ISG稳定诱导过表达细胞系和基于HIV骨架的表达新冠病毒包膜蛋白突变体的假病毒。

进一步地，所述干扰素刺激基因ISG稳定诱导过表达细胞系由Flp-InTMT-RExTM-293细胞转染待评价的干扰素刺激基因蛋白分子表达载体质粒制成。