[发明专利]一种生物活性次级代谢产物及其制备和应用

权利要求书

1.一种生物活性次级代谢产物，其特征在于：生物活性次级代谢产物为下述化合物1-3、7：。

2.一种如权利要求1所述的生物活性次级代谢产物的制备方法，其特征在于：

1) 将植物内生真菌F4a接种于PSA固体培养基上培养48-96 h活化，活化后接种于液体培养基中于28-32℃培养48-72 h所得培养物作为种子液；将所得种子液与液体培养基按体积比1:25-1:15混合，26-32℃振荡培养6-9天；

2) 将发酵液离心去菌体获得发酵上清液，用大孔吸附树脂HP20固相吸附发酵液中活性成分，树脂与发酵液体积比为1:15-1:25；吸附1-3 h，吸附后洗涤获得粗提物；分离所得菌体经丙酮提取获得粗提物，合并粗提物即得总提取物A；

3) 将总提取物A，采用硅胶柱色谱法分离，按照二氯甲烷：甲醇(v/v)比为100:0-0:100梯度洗脱，收集各组分，即得生物活性次级代谢产物。

3.按权利要求2所述的生物活性次级代谢产物的制备方法，其特征在于：所述步骤3）经硅胶柱色谱法分离，纯二氯甲烷洗脱为流分F_a,二氯甲烷：甲醇的体积比为100:1-100:3洗脱为流份F_b,二氯甲烷：甲醇的体积比为100:4-100:6洗脱为流份F_c,二氯甲烷：甲醇的体积比为100:7-10:9洗脱为流份F_d,二氯甲烷：甲醇的体积比为100:10-100:15洗脱为流份F_e；

将流分F_b经凝胶LH20分离，按照洗脱甲醇体积数分成4个亚流分，根据洗脱顺序接收40-60 mL甲醇为亚流分F_b4，接收62-100 mL甲醇为亚流分F_b3，接收102-120 mL甲醇为亚流分F_b2，接收125-140 mL甲醇为亚流分F_b1；将亚流分F_b3用半制备HPLC纯化，经35-45%的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0 mL/min，获得化合物7；

将流份F_c经凝胶LH20分离，按照洗脱甲醇体积数收集2个亚流分，根据洗脱顺序收集50-78 mL甲醇为亚流分F_c2，收集80-100 mL甲醇为亚流分F_c1；将获得F_c2经ODS反相柱层析分离获得6个亚流分F_c2a-F_c2f，其中35-42%甲醇水洗脱的为F_c2a，43-46%甲醇水洗脱的为F_c2b，48-52%甲醇水洗脱的为F_c2c，53-57%甲醇水洗脱的为F_c2d，58-62%甲醇水洗脱的为F_c2e，63-66%甲醇水洗脱的为F_c2f；将亚流分F_c2a用半制备HPLC纯化，40-50%的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0mL/min，获得化合物1；将亚流分F_c2b用半制备HPLC纯化，45-55%的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0 mL/min，保留时间t_R 19-22 min获得化合物3；

将流份F_d经ODS反相柱层析分离获得2个亚流分F_d1-F_d2，其中35-42%甲醇水洗脱的为F_d1，43-48%甲醇水洗脱的为F_d2；将亚流分F_d1经35-45%的甲醇水溶液洗脱，流速为2.0 mL/min，获得化合物2。

4. 按权利要求2所述的生物活性次级代谢产物的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中液体培养基为每升水中淀粉10 g，葡萄糖20 g，酵母提取物1 g，黄豆饼粉0.5 g，大麦提取物2.5 g，硫酸氨1 g，硝酸钾0.8 g，碳酸钙4 g，七水合硫酸镁2.5 g，磷酸二氢钾3 g，硫酸铜0.02 g，pH7.0。