[发明专利]一种筛选单拷贝T-DNA转基因植株的方法

权利要求书

1.一种筛选单拷贝T-DNA转基因植株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.从待测植物基因组中选择一对参考序列R₁和R₂，再从相应二元载体上选择T-DNA序列，针对所述R₁、R₂、T-DNA序列设计实时定量PCR引物，使已知转基因拷贝数为2的标准植株的R₁和R₂的Ct值相差0.95～1.05、Ct_R1Ct_R2，且T-DNA序列的Ct值介于R₁和R₂之间，即构成R₁-T-R₂的Ct值关系；所述Ct值分布在15～20之间；所述参考序列选自单拷贝基因；

S2.从待测的T₁代T-DNA转基因植株中挑选不含载体骨架序列的clean T-DNA植株；

S3.提取clean T-DNA植株基因组DNA，酶切基因组DNA解开反向串联T-DNA结构；所述酶切基因组DNA解开反向串联T-DNA结构为根据所用二元载体，在扩增的T-DNA区域两端，且位于LB和RB间选择合适的酶切位点进行酶切；

S4.以酶切处理后的基因组DNA为模板，利用步骤S1设计的实时定量PCR引物进行扩增，获得稳定的Ct值；

S5.根据Ct值关系进行判断，若Ct值关系为R₁-R₂-T，则检测植株为单拷贝转基因植株；若为R₁-T-R₂，则为双拷贝转基因植株；若为T-R₁-R₂，则为多拷贝转基因植株；

所述植物为拟南芥。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2所述挑选不含载体骨架序列的cleanT-DNA植株的方法为针对载体骨架序列设计引物，并通过常规PCR，区分clean T-DNA和含有载体骨架序列的dirty T-DNA植株或者在载体骨架序列区插入具有致死基因Barnase进行负筛选，挑选出clean T-DNA植株。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，在步骤S3、S4之间还包括利用标准模板进行Ct值关系验证；所述标准模板为包含有步骤S1所述参考序列R₁、R₂和T-DNA序列的具有单、双拷贝的单一位点插入的转基因标准植株或包含有步骤S1所述参考序列R₁、R₂和T-DNA序列的质粒。