[发明专利]一种eef1b2基因敲除斑马鱼癫痫模型及其应用

说明书

本发明通过CRISPANT技术，在斑马鱼eef1b2基因第二个外显子上插入5bp片段同时缺失3bp片段，选育出eef1b2基因缺失型斑马鱼，从而构建斑马鱼癫痫模型。本发明使用四个sgRNA靶向同一基因，可以最大限度地提高编辑效率，更有效进行基因编辑。本发明提供的斑马鱼癫痫模型为进一步开展EEF1B2突变与癫痫发病机制的关系研究及筛选抗癫痫药物奠定了很好的基础。

技术领域

本发明涉及基因敲除技术领域，具体涉及一种eef1b2基因敲除斑马鱼癫痫模型及其应用。

背景技术

CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前，CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。研究人员发现使用多个sgRNA靶向同一基因，可以最大限度地提高编辑效率，并将这种方法命名为CRISPANT技术。

在前期的癫痫患者的全外显子组测序(WES)结果中，筛选到可能引起癫痫疾病的基因EEF1B2，且经文献查询，未发现有eef1b2突变癫痫斑马鱼系的报道。斑马鱼作为脊椎动物，具有复杂的神经系统，遗传结构与人类相似，约70％的基因与人类共享，约84％的人类疾病已知相关基因也在斑马鱼中表达。与小鼠等啮齿类动物相比，斑马鱼遗传操作简单，更适合用于制备癫痫模型。且斑马鱼eef1b2基因进化上较为保守，研究发现eef1b2在斑马鱼胚胎早期表达量特别高。因此，本发明旨在利用CRISPANT技术建立eef1b2基因敲除斑马鱼癫痫模型，该斑马鱼系可用于研究EEF1B2突变与癫痫发病机制的关系及后续抗癫痫药物筛选。

发明内容

本发明提供了一种eef1b2基因敲除斑马鱼癫痫模型及其应用，以为进一步开展EEF1B2突变与癫痫发病机制的关系研究及筛选抗癫痫药物奠定基础。

本发明采用以下技术方案：

本发明第一方面提供了一种斑马鱼癫痫模型，是利用sgRNA组合敲除斑马鱼eef1b2基因来构建，所述sgRNA组合序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示，所述敲除斑马鱼eef1b2基因是在斑马鱼eef1b2基因第二个外显子上插入5bp片段同时缺失3bp片段，其序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

本发明第二方面提供了一种sgRNA组合在构建斑马鱼癫痫模型中的应用，是利用所述sgRNA组合敲除斑马鱼eef1b2基因来构建斑马鱼癫痫模型，所述sgRNA组合序列如SEQID NO.1至SEQ ID NO.4所示，所述敲除斑马鱼eef1b2基因是在斑马鱼eef1b2基因第二个外显子上插入5bp片段同时缺失3bp片段，其序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

本发明第三方面提供了所述斑马鱼癫痫模型在筛选抗癫痫药物中的应用。

本发明第四方面提供了一种斑马鱼癫痫模型的构建方法，包括如下步骤：

1)、靶向CRISPANT基因的sgRNA组合和检测引物的筛选：sgRNA组合序列如SEQ IDNO.1至SEQ ID NO.4所示，检测引物序列如SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.6所示；

2)、将4个sgRNA和Cas9蛋白混合物注射到斑马鱼的受精卵中；

3)、F0代突变斑马鱼筛选：筛选出敲除有效的胚胎，培养至成鱼，获得F0代突变斑马鱼；