[发明专利]一种用于阪崎克罗诺杆菌检测的新靶标、引物组及其检测方法

权利要求书

1.核苷酸序列在检测阪崎克罗诺杆菌中的应用，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQID No.1所示。

2.用于检测阪崎克罗诺杆菌的引物组，其特征在于，所述引物组根据如权利要求1所述的核苷酸序列设计得到，具体包含以下引物：

外引物F3：5’-ATCTCGCTGCCCGCTATC-3’；

外引物B3：5’-GTATGCTCCCAGTACGTGTC-3’；

内引物FIP：5’-ACTGATGCGATTTACGACGGGTCACGGTGAATGATGCCCA-3’；

内引物BIP：5’-GGCGCTTCGGTATGTCCTGGTCTCCCGGTTCCCTGATC-3’。

3.一种可视化检测阪崎克罗诺杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、利用DNA提取液提取待检测样本的DNA；

S2、以S1获得的样本DNA为模板，建立阪崎克罗诺杆菌的LAMP体系，再加入HNB染料进行扩增；

S3、观察颜色变化，若扩增产物由紫罗兰色变为天蓝色，则表明待检测样本中含有阪崎克罗诺杆菌，若扩增产物呈现紫罗兰色，不发生变化，则表明待检测样本中不含有阪崎克罗诺杆菌。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S1所述DNA提取液的组成为珠状Chelex-1005g，NP 401mL和TE溶液19mL，pH为8.0～9.0；所述TE溶液由10mM Tris-HCl和1mM EDTA配制获得。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S1所述的DNA提取方法如下：取300μL～1mL待检测样本于2mL EP管中，4℃、12000rpm离心2min，弃去上清液，向沉淀中加入300μLDNA提取液，混匀后于56℃孵育30min，再于90℃～100℃下水浴8min～10min，然后4℃、12000rpm离心2min，取上清液即为DNA。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S2所述阪崎克罗诺杆菌的LAMP体系总体积为25μL，包括如下成分：权利要求2所述的引物组、dNTP、Mg²⁺、10×ThermoPol Buffer、Bst2.0WarmStart DNA聚合酶和模板DNA；所述引物组中外引物与内引物的浓度比为1:8，dNTP终浓度为1.8mM～2.2mM，Mg²⁺终浓度为3～5mM，10×ThermoPol Buffer添加量为2.5μL，Bst2.0WarmStart DNA聚合酶的初始浓度为8000U/mL，添加量为0.8μL，模板DNA添加量为2μL。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S2所述HNB染料的终浓度为120μM～180μM。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S2所述扩增反应的温度为62℃～64℃。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S2所述扩增反应的时间为30～60min。

10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S1所述样本为乳粉时，样本前处理方法如下：取10g乳粉溶于90mL无菌的蛋白胨水溶液中并混合均匀，4℃、5000rpm离心5min，弃去上清液；将沉淀复溶于的蛋白胨水溶液中进行二次离心，加入BPW复溶并用于DNA的提取。