[发明专利]一种高纯度外泌体提取试剂盒及其提取方法

说明书

本发明公开了一种高纯度外泌体提取试剂盒及其提取方法，属于外泌体分离技术领域，一种高纯度外泌体提取试剂盒的提取方法，包括样本准备、蛋白A琼脂糖纯化珠的准备和亲和捕获，本方案还提供一种高纯度外泌体提取试剂盒，包括盒体、盒盖以及装载在盒体内的采集管、滤器、试剂瓶，若干试剂瓶内分别封装有蛋白A琼脂糖纯化珠、抗体混合物、清洗液、洗脱液、血液促凝剂和PBS缓冲液，本方案通过采用免疫亲和捕获法获取血液/体液中的外泌体，可以为不同来源外泌体的高纯度提取提供了稳定、有效的方案，所获得外泌体纯度高，可用于RNASeq、质谱检测等对外泌体纯度要求高的下游分析和液体活检标志物筛选。

技术领域

本发明涉及外泌体分离技术领域，更具体地说，涉及一种高纯度外泌体提取试剂盒及其提取方法。

背景技术

外泌体是细胞分泌的直径约30-150nm的细胞外囊泡，广泛存在于血液、唾液、尿液、乳汁等体液中，它们包裹着核酸、蛋白、氨基酸、脂类等生物大分子，被受体细胞内吞后，可以释放上述效应物分子，参与调节细胞的生物学活动。探讨外泌体内生物大分子的组成，改造外泌体使其成为药物载体，已经成为当前生命科学重要的研究课题。

当前外泌体提取的主要方法有：1.差速离心法：运用最多，利用低速离心-高速离心交替原理将外泌体沉淀下来。优点：成本低，纯度高，适合制备大样本；缺点：设备要求高，耗时，高强度的离心力可能对外泌体造成机械损伤，容易造成脂蛋白等聚集2.密度梯度离心：利用蔗糖溶液形成从低到高的浓度阶层，通过离心，使外泌体集中在1.13-1.19g/ml的密度范围。优点：纯度高缺点：样本处理量低，设备要求高，耗时，高强度的离心力可能对外泌体造成机械损伤3.超滤膜离心分离法：外泌体大小比蛋白质大，利用超滤膜进行节流，将外泌体分离出来。优点：是简单高效，设备成本低，外泌体生物活性保存好缺点：是也存在纯度不高的问题，容易引起膜堵塞。另外，近年来也开发了一些新型的分离技术，如纳米线分离法、微流控法等，或者用核酸配适体亲和技术进行分离外泌体，但设备、成本要求高。

外泌体提取是上述研究的关键环节，而基因组学的研究对外泌体的获取提出了更高的要求，如何获取高纯度外泌体并满足基因组学的研究变得尤为重要。为此我们提出一种高纯度外泌体提取试剂盒及其提取方法来解决以上问题。

发明内容

1.要解决的技术问题

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种高纯度外泌体提取试剂盒及其提取方法，可以实现利用亲和捕获技术(免疫亲和法)，为不同来源外泌体的高纯度提取提供了稳定、有效的方案，利用本试剂盒获取的外泌体可用于RNASeq、质谱检测等对外泌体纯度要求高的下游分析。

2.技术方案

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。

一种高纯度外泌体提取试剂盒提取方法，包括以下步骤：

S1、样本准备：

A.全血：

①采集管预先加入适量溶液A(按每5mL全血加20μL的比例)，将3mL新鲜全血注入采集管中，轻微颠倒混匀，静置30min至血液凝固；

②将上述血液在分离温度4℃、分离因素3000g的条件下离心5分钟，取上清即为血清，置于1.5mL离心管中；重复离心1次，吸取上清；

③注射器吸取上述离心后的血清，滤器过滤后，转移至新的离心管备用；

④检测上述10mL样本液pH值，使用HCl或NaOH调整pH值至7.2-7.4；

B.血浆：

①新鲜血浆，置于采集管中，按每5mL血浆加20μL的比例加入溶液A，轻微颠倒混匀，静置30min；