[发明专利]利用荧光定量PCR检测ZNF384基因重排的引物和探针及试剂盒

说明书

本发明公开了一种利用荧光定量PCR检测ZNF384基因重排的引物和探针及试剂盒。本发明能够对人类B‑ALL中ZNF384基因重排进行检测，可有效的节约检测时间，提高检测精度，有助于临床上B‑ALL患者体内ZNF384基因重排的检测，对于分型诊断、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。

技术领域

本发明属于生命科学和生物技术领域，涉及一种临床检验用途的基因检测方法，采用探针实时荧光PCR技术，能够对人类B-ALL中ZNF384基因重排进行检测，可有效的节约检测时间，提高检测精度。

背景技术

B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)是一种可致命的血液癌症，其癌细胞通常多次发生染色体结构突变，包括非整倍体和基因重排等，导致部分原癌基因的表达失去控制或者产生某些功能异常的融合蛋白。这些融合蛋白的形成常常会影响血细胞分化、染色体重塑、细胞分裂等过程，成为癌变的重要推手。B-ALL占儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)的85％～90％，占成人ALL的75％。大部分儿童患者可通过正规化疗获得长期无病生存，5年无病生存率约为80％，而成人的预后明显比儿童差，其5年无病生存率仅为40％。65％～80％的ALL患者可检测出克隆性染色体畸变，其中66％为特异性染色体重排，许多常见重排往往是致病的主要遗传因素。

ZNF384基因编码一种转录因子，可结合并调节细胞外基质基因MMP1、MMP3、MMP7及COL1A1的启动子。ZNF384基因重排常见于伴髓系抗原表达的B-ALL患者，分别占儿童和成人B-ALL的3％～4％和7％。常见的累及ZNF384基因重排的对手基因包括TCF3、TAF15及EWSR1等。伴有ZNF384基因重排的B-ALL患者预后中等，可上调CLCF1及BTLA基因表达水平，激活了JAK-STAT信号通路，可能对JAK-STAT通路抑制剂敏感。ZNF384基因位于12p13.31，由10个外显子组成，编码516个氨基酸。TCF3基因位于19p13，由19个外显子组成，与ZNF384基因重排有五种：TCF3 Ex11-ZNF384 Ex3、TCF3Ex13-ZNF384 Ex3、TCF3 Ex13-ZNF384 Ex2、TCF3Ex16-ZNF384 Ex2、TCF3Ex17-ZNF384 Ex7。TAF15基因位于17q12，与ZNF384基因主要有两种重排：TAF15 Ex6-ZNF384 Ex3和TAF15 Ex9-ZNF384 Ex3。EWSR1基因位于22q12，与ZNF384基因有两种重排：EWSR1 Ex7-ZNF384 Ex3和EWSR1 Ex7-ZNF384Ex2。

ZNF384重排检测的常用技术有荧光原位杂交技术(FISH)、RQ-PCR等方法。FISH检测结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。RQ-PCR采用Taqman探针荧光定量技术，综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对PCR产物的准确定量，易于统一标准，与定性PCR技术相比，具有特异度好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染，有较大的线性范围等优点。能够满足ZNF384基因重排的检测，被认为是目前首选检测方法，用于评价治疗效果、预测预后。实时荧光定量PCR中常见的方法有SYBR GreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBR GreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针杂交法成本又较为昂贵。因此本研究采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于ZNF384的基因重排检测。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本项目探讨一种基于实时荧光PCR的方法，能够筛查血液病相关ZNF384基因重排的九种形式，加强对B-ALL的认识，可应用于该型白血病的早期检测、疗效评价和复发风险的判断，对促进B-ALL发病机制的理解、开发针对性的靶向治疗及促进精准医疗具有重要意义。