[发明专利]一种人肝微粒体与细胞共培养体系及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种人肝微粒体与细胞共培养体系及其构建方法和应用。人的肝源很难保证无菌，在制备人源肝微粒体时，几乎无法获得无菌的肝微粒。为了将人源肝微粒体与细胞共培养进行体外代谢试验研究，本发明提供了一种能够将有菌的人肝微粒体与无菌细胞直接接触的共培养方法，成功构建了人肝微粒体与细胞共培养体系。试验证明，本发明的构建方法能够保证人肝微粒体中的污染源无法对细胞的无菌环境造成影响，维持细胞正常生长的无菌状态。并且，该方法适用于外源物质(如烟碱、烟气)体外代谢研究，为人源肝微粒体与细胞共同作用的体外代谢研究奠定了基础。

技术领域

本发明属于细胞共培养技术领域，具体涉及一种人肝微粒体与细胞共培养体系及其构建方法和应用。

背景技术

肝微粒体是从肝细胞内质网碎片中得到的小型囊泡，直径约为0.1μm，具有完整的I相代谢酶(如细胞色素P450、黄素单加氧酶、单胺氧化酶等)，II相代谢酶(如葡萄糖醛酸转移酶，硫酸基转移酶)、酯酶等，这些酶参与人体内药物代谢情况，是FDA指定预测人体内代谢及抑制试验的研究工具。

在进行与细胞共同参与的代谢活化试验时，通常将无菌鼠肝微粒体+代谢活化体系与外源物质加入培养基中共同作用细胞。而由于种属差异的存在，鼠肝微粒体中代谢酶并不能完全符合实验的需要，如研究报道鼠肝微粒体中CYP2A6酶低表达或者不表达。CYP2A6酶是CYP450酶系亚家族CYP2A中的重要一员，负责烟碱、咖啡因等药物的代谢。因此，在做烟碱及咖啡因等药物代谢相关研究时，通常需选择供体来源丰富的人源肝微粒体如25供体人肝微粒进行代谢活化实验研究，而由于人的肝源很难保证无菌，在制备人源肝微粒体时，几乎无法获得无菌的肝微粒，因此，将有菌的人肝微粒体用于无菌的细胞实验需保证人肝微粒体中的污染源无法对细胞的无菌环境造成影响，以维持细胞正常生长的无菌状态。目前，将人肝微粒体用于无菌的细胞实验鲜有报道。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种人肝微粒体与细胞共培养体系的构建方法，抑制了人肝微粒体的有菌污染源，使人肝微粒体在无菌体系不影响细胞生长。

本发明的第二个目的在于提供上述构建方法的应用。

本发明的第三个目的在于提供一种人肝微粒体与细胞共培养体系。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种人肝微粒体与细胞共培养体系的构建方法，包括以下步骤：

1)以二甲胺四环素盐酸盐、青霉素、链霉素、NADPH再生系统、人肝微粒体和基础培养基配制孵育代谢培养基溶液；所述孵育代谢培养基溶液中，二甲胺四环素盐酸盐的终浓度为2～3μg/mL，青霉素的终浓度为80～120U/mL，链霉素的终浓度为80～120μg/mL；最优为：所述二甲胺四环素盐酸盐的终浓度为2.5μg/mL，所述青霉素的终浓度为100U/mL，所述链霉素的终浓度为100μg/mL。

2)使用孵育代谢培养基溶液培养细胞，实现人肝微粒体与细胞的共培养。

人的肝源很难保证无菌，在制备人源肝微粒体时，几乎无法获得无菌的肝微粒。为了将人源肝微粒体与细胞共培养进行体外代谢试验研究，本发明提供了一种能够将有菌的人肝微粒体与无菌细胞直接接触的共培养方法，成功构建了人肝微粒体与细胞共培养体系。试验证明，本发明的构建方法能够保证人肝微粒体中的污染源无法对细胞的无菌环境造成影响，维持细胞正常生长的无菌状态。

该方法因为使肝微粒体在无菌体系不影响细胞生长，即抑制了肝微粒体的有菌污染源，适用于Beas-2b等常用细胞。基础培养基为共培养细胞常用培养基。

一般而言，步骤1)中，人肝微粒体的终浓度为1mg/mL，NADPH再生系统的体积百分浓度为6％。