[发明专利]循环肿瘤DNA参考品的制备方法、产品及用途

说明书

本申请提出了一种制备循环肿瘤DNA参考品的方法，该方法包括：将获得的肿瘤细胞进行诱导细胞凋亡，以便获得具有断裂DNA的肿瘤细胞；对所述具有断裂DNA的肿瘤细胞进行DNA提取，以便获得所述循环肿瘤DNA参考品。本申请所提出的参考品制备方法简单易行，适合于各种肿瘤细胞的循环肿瘤DNA参考品制备，并且其所保留的变异信息能够模拟动物体内循环肿瘤DNA的情况，利于检测方法的校正、评估。

技术领域

本申请属于生物技术领域，具体地，涉及循环肿瘤DNA参考品的制备方法、产品及用途。

背景技术

循环游离DNA(circulating cell-free DNA,cfDNA)是细胞凋亡或坏死后释放入血的，通常其长约150到200个碱基对，半衰期约0.5-1小时。在正常人体中，cfDNA含量极微，通常为10-15ng/mL，而肿瘤患者的cfDNA含量明显升高。肿瘤患者中，外周血所测得的肿瘤细胞所释放的DNA又称为循环肿瘤DNA(ctDNA，circulating tumor DNA)，ctDNA是cfDNA的一部分。肿瘤患者中，ctDNA占cfDNA的比例差异巨大，少至0.1％，多到超过90％。随着新一代测序技术(Next-Generation Sequencing，NGS)的出现，大规模平行测序成为可能，相较于第一代测序技术，NGS技术检测速度快、准确率高、成本低、覆盖度广。随着NGS技术的不断成熟，加上其具有传统测序技术所缺乏的精确、灵敏、价廉、平行大规模处理等优势，利用NGS检测cfDNA这一技术在肿瘤的早期诊断和筛查、用药指导、疗效和耐药监测、复发监测和预后判断等方面得到了广泛的应用。之前的研究关于cfDNA的研究主要侧重在不同类型变异(点突变、插入、缺失等)、拷贝数变异以及基因相关性和多态性进行分析。目前越来越多的研究表明cfDNA在基因组中的片段化模式在正常人和癌症患者中有着明显的差异，在不同组织来源的癌症中其模式也存在着差别。通过将cfDNA片段化模式纳入考量，可以评估受检者是否具有癌症信号，以及溯源癌症发生部位。

然而对于cfDNA的单核苷酸变异(single nucleotide variant,点突变)、结构变异(structural variation,SV)、拷贝数变异(CNV)以及片段化大小(fragment size)等变异信息的检测性能，需要建立参考物质。参考物质作为一把“标尺”，完成方法建立、方法优化和性能确认的过程，在方法应用于临床之前，体现方法检测的真实性能。此外，实验室进行室内质量控制，第三方机构开展室间质量评价、能力验证，均需要相应的参考物质来保证检测结果的可靠性。参考物质是实现高通量测序检测标准化、进行性能确认或性能验证、室内质量控制和室间质量评价最重要的前提物质条件。

理想的参考物质来源于临床样本，但临床样本都属于珍贵的研究材料，且数量有限，很难作为参考物质的长期来源。

由此，开发一种可以代替临床样本、与临床样本一致性高、制备简单的循环肿瘤DNA参考品至关重要。

发明内容

发明人发现，血浆中游离DNA来自凋亡的片段特征与人基因组DNA是完全不同的。以往制备cfDNA标准品通常采用超声或者片段化酶切等方法将人基因组DNA打断至100～200bp，但是片段含有的序列信息、片段长度和随机分布的特点均与真实样本不符。而目前最常用的是微球菌核酸酶(Micrococcal nuclease；MNase)酶切的方法。MNase是一种可以降解核小体连接区DNA的核酸酶，MNase消化染色质可以释放出一个个独立的核小体，这种方法得到的模拟cfDNA样本则片段长度为146bp左右，相对真实血浆样本中cfDNA组分长度(主峰分布在166bp)较短。并且MNase酶解法具有一定的局限性，首先，MNase偏向于切割A/T碱基位点，导致核小体在A/T富集区域的表达量低于真实情况；其次，MNase不能在核小体边界精确切割，这导致在确定染色质的开放位置与真实情况存在差异；而且，MNase偏向于消化脆性核小体。故MNase无法制备模拟cfDNA组分样本。因此，建立一种可以用于cfDNA变异信息检测的参考物质就显得尤为重要。