[发明专利]阿龙山病毒环介导等温扩增检测引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种阿龙山病毒环介导等温扩增检测引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用。本发明根据阿龙山病毒基因组VP2基因的保守区设计了三套引物用于环介导等温扩增方法建立，最终筛选出一套用于检测的引物组。根据所设计的引物建立了一种基于环介导等温扩增技术检测阿龙山病毒的方法。本发明建立的LAMP检测方法特异性高，不与其他病毒交叉反应，且最低检测限可达到2.86copy/μL。应用于检测阿龙山病毒的检测，可以实现该病毒的即时检测，检测灵敏度和特异性高，人工和器材成本低，周期短。这种快检技术可推广应用于阿龙山病毒的流行病学调查和疫情监控，具有良好的实践意义和广阔的市场前景。

技术领域

本发明涉及一种检测阿龙山病毒的环介导等温扩增引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用。本发明属于病毒检测技术领域。

背景技术

阿龙山病毒(Alongshan virus，ALSV)是一种新发现的分节段的黄病毒，主要通过蜱虫叮咬传播，感染牛、羊、人等。ALSV与荆门蜱病毒在进化上密切相关，基因组都分为四个片段，全长11350bp，S1片段长2995bp编码黄病毒NS5样NSP1蛋白；S3片段长2811bp编码黄病毒NS2b-NS3样蛋白NSP2；S2片段长2806bp，编码糖蛋白VP1；S4片段长2738bp，编码核蛋白VP2和膜蛋白VP3。

阿龙山病毒是在我国的内蒙古的东北部地区首次发现，随后在芬兰和俄罗斯地区发现的蜱类体内发现。由于该病毒的是新发现的分节段黄病毒，目前阿龙山病毒的分子生物学、免疫学检测方法以及致病机制都是空白。而通过对黄病毒的综述分析，推断阿龙山病毒传播地区比目前所检测到地区更广，因此需要更快速、更简便的方法进行更多地区和更多宿主的检测。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi等人发展起来的。LAMP具有较高的特异性和灵敏度，使用简单，不需要专门的设备。LAMP是用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶(即来自嗜热脂肪芽孢杆菌的修饰DNA聚合酶)进行的。温度从60℃到65℃，在等温条件下在30-60min内完成检测。最终的扩增产物是带有不同茎的茎环DNA的混合物，可以通过直接观察或通过琼脂糖凝胶进行分析。LAMP方法已被开发用于检测多种病毒，包括口蹄疫病毒、登革热病毒、风疹病毒和西尼罗河病毒，但尚未应用于检测ALSV。

本发明建立ALSV的LAMP检测方法，是特异、稳定，灵敏、高效的技术检测体系，在ALSV的检测方面具有重要的应用价值。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供一种检测ALSV的环介导等温扩增引物组。应用该引物组可为基层现场检测提供一种简便、快捷地检测ALSV的方法。

本发明的第二个目的是提供一种含有上述引物组的检测ALSV的环介导等温扩增反应试剂盒。

本发明的第三个目的是提供上述引物组以及试剂盒在检测样品中ALSV中的应用。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明从Genbank数据库中检索并获得所有ALSV的全基因组序列，通过BLAST软件进行同源性分析，找到ALSV基因组相对保守的靶基因(VP2)序列，根据VP2序列，利用PrimerExplorerV5软件设计出用于ALSV检测的LAMP引物组，经筛选后最终得到了一套可特异、灵敏的检测ALSV的引物组合物。

本发明的一种用于检测阿龙山病毒(Alongshan virus，ALSV)的环介导等温扩增引物组，所述的引物组由1对外引物F3/B3以及1对内引物FIP/BIP组成，所述的引物序列如下：

F3：TGATCTACATCCTCGCCGT

B3：CTGCTCCTGCTGTGAGTG