[发明专利]抑制长链非编码RNA MALAT1表达的shRNA慢病毒及其应用

说明书

本发明提供了抑制长链非编码RNA MALAT1表达的shRNA，其针对Genbank中MALAT1转录本序列NR_002847.3的286、743、1048、4807位点或其他转录本序列中的对应位点设计；本申请还提供了相应质粒、慢病毒、药物组合物及其在治疗认知障碍中的应用。本发明的MALAT1‑shRNA干扰质粒能显著特异性抑制海马神经元内MALAT1的表达，促进神经元细胞周期的进程，抑制神经元凋亡和凋亡关键蛋白的表达，从而起到抵抗应激诱导的神经元细胞损伤的作用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抑制长链非编码RNA MALAT1表达的shRNA慢病毒及其应用。

背景技术

随着现代社会生活节奏的加快和社会竞争的加剧，多数人都处在不同程度的应激负荷之下，长期过度应激已被确认为人类多种重大致死性疾病的重要推动因素，人类约70％的疾病的发生发展与机体应激损伤密切相关。大脑是机体感应和应对应激的调控中枢，同时也是应激易损伤的靶器官，尤其是涉及高级脑活动的认知功能在面对应激时显得尤为脆弱。流行病学调查显示，长期处于应激状态的人群其轻度认知障碍和痴呆的患病率是同年龄非应激人群的两倍以上。在确诊的认知功能障碍患者当中，超过70％伴随有HPA轴的功能紊乱。海马是调控学习、记忆等认知功能的重要脑区，慢性应激可导致海马的结构和功能改变，包括引起海马体积缩小、树突棘数量减少、突触密度降低、突触可塑性异常、抑制齿状回神经发生等。应激已经被证明是认知功能损伤甚至痴呆的重要风险因素。应激反应以下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)轴功能亢进和糖皮质激素(glucocorticoid,GC)大量分泌为主要特征，高浓度GC对神经元的损伤作用是应激诱导认知功能障碍发病的重要机制之一，但临床上尚缺乏针对应激性认知功能障碍的有效防治药物。

长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是指长度大于200nt，不能编码产生蛋白的一类表观遗传调控分子，其含量占到非编码RNA的80％以上，与发育、细胞增殖与凋亡、代谢、免疫调节、各种疾病发生等几乎所有的生理病理过程的调控密切相关。肺癌转移相关转录本1(Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)，于2003年在非小细胞肺癌组织中被首次鉴定发现，是发现较早且迄今研究最为深入的lncRNA之一。MALAT1在生物体内具有较高的表达水平且表达相对普遍，在哺乳动物进化中具有高度保守性。早期对MALAT1的研究主要集中在肿瘤领域，发现MALAT1参与了细胞增殖、凋亡、耐药、转移等细胞行为的调控作用，与多种肿瘤的发生发展密切相关。近年来越来越多的证据表明MALAT1在学习、记忆等脑认知功能及相关疾病的调控中发挥了重要生物学作用。有研究发现在(Parkinson’s disease，PD)患者、PD动物模型以及阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)大鼠脑组织中MALAT1的表达水平发生了不同程度的变化，且MALAT1可通过调节染色质表观修饰、控制基因转录、调节蛋白质功能、竞争结合microRNA等多种分子机制发挥多种生物学功能。还有研究提示，在神经细胞中干扰MALAT1可影响细胞对GC刺激的应答，提示MALAT1有可能参与调控应激反应。但MALAT1在应激性认知功能障碍中的作用迄今未见报道，目前也并没有靶向MALAT1治疗应激性认知功能障碍的相关技术。

基因治疗是指将特定的遗传物质转入患者特定的靶细胞，以最终达到预防或改变特殊疾病状态的治疗方法。慢病毒(lentivirus,LV)载体是基因治疗中最常用的病毒载体，可以感染分裂和非分裂期的细胞，还具有容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小、产物可稳定长期表达等优点，其独特的优势使其在基因治疗中具有广泛的应用前景。目前已有研究证实，以慢病毒为载体的基因治疗方法在重症联合免疫缺陷病、法布里病、肾上腺脑白质失养症等多种疾病的治疗中安全且有效。

发明内容