[发明专利]Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白及其制备方法有效
| 申请号： | 202111042242.3 | 申请日： | 2021-09-07 |
| 公开（公告）号： | CN113621079B | 公开（公告）日： | 2023-04-11 |
| 发明（设计）人： | 郭清红;田翀;任俊英 | 申请（专利权）人： | 金标优尼科（无锡）生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C07K19/00 | 分类号： | C07K19/00;C12N9/16;C12N15/62;C12N15/85;G01N33/535;G01N33/58 |
| 代理公司： | 北京中政联科专利代理事务所(普通合伙) 11489 | 代理人： | 李阳 |
| 地址： | 214000 江苏省无锡市惠*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | fab 抗体 小牛 碱性磷酸酶 融合 蛋白 及其 制备 方法 | ||
1.Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由目标抗体的Fab片段和小牛肠碱性磷酸酶由连接肽链接构成，编码小牛肠碱性磷酸酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述连接肽为柔性连接肽或刚性连接肽，所述柔性连接肽为(GGGGS)n或(GGGS)n，刚性连接肽为A(EAAAK)nA，n为3,4,5,6,7,8之一。
2.根据权利要求1所述Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白，其特征在于，目标抗体选自人源抗体，鼠源抗体，羊源抗体，兔源抗体，马源抗体，鸡源抗体或嵌合抗体。
3.根据权利要求2所述Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白，其特征在于，所述嵌合抗体选自人鼠嵌合抗体，人兔嵌合抗体或鼠兔嵌合抗体。
4.权利要求1-3任一项所述Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白的制备方法，其特征在于，具体制备方法的步骤如下：
a.根据目标抗体的VL-CL和VH-CH1核苷酸序列，连接肽核苷酸序列，小牛肠碱性磷酸酶的核苷酸序列，采用重叠PCR技术合成基因，合成后酶切基因，分别连接到载体上；
b.将构建后的重组载体转染到哺乳细胞中，经培养细胞后，即可在细胞培养液上清得到Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤b中哺乳细胞为CHO细胞，HEK293细胞，Expi293细胞，COS7细胞，NSO细胞或BHK21细胞。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述载体为pCDNA/GS载体，重组载体转染到哺乳细胞后还包括步骤c，将用抑制剂加压筛选表达高活性蛋白的克隆，再采用批培养，Fed-batch培养筛选，结合高通量酶活鉴定方法，获取高表达Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白稳定细胞株，继续放大Fed-batch培养生产，10-14天后收集上清。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤b中培养细胞时，培养基中含有2mM MgCl2,0.1mM ZnCl2。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，还包括步骤d蛋白纯化，收集细胞培养液上清，加入50-55％硫酸铵沉淀，沉淀溶解于缓冲液A中，经Phenyl HP疏水层析，洗脱蛋白再经DEAE弱阴离子交换层析，最后得到的高活性Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白；所述缓冲液A为20mMTris,2mM MgCl2,0.08mM ZnCl2,1M硫酸铵，pH7.5。
9.权利要求1-3任一项所述Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白在制备免疫检测试剂中的应用。
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