[发明专利]全景旋转内窥双光子显微成像系统

说明书

本发明公开了一种全景旋转内窥双光子显微成像系统，包括：近红外飞秒脉冲激光器、主机、成像探头组件和轴向扫描装置，所述成像探头组件包括旋转输出单元以及旋转驱动单元；所述旋转输出单元植入到动物的脑组织中，用于将飞秒脉冲激光导入脑组织，并收集脑组织被激发而产生的荧光。本发明将高速旋转扫描与微型内窥双光子成像系统结合，提出了一种能特别适用于灵长类较大型动物的全景内窥双光子显微成像系统，通过将成像探头组件的旋转输出单元置入到脑组织，藉由360度环形柱面扫描能实现所观察脑区内360度全景成像，藉由轴向扫描进行不同深度的探测，能实现从深脑区到脑皮层管道所覆盖连续多个脑功能区的神经活动观测。

技术领域

本发明涉及显微成像技术领域，特别涉及一种全景旋转内窥双光子显微成像系统。

背景技术

目前，介观神经环路研究日益成为健康和疾病中大脑功能研究的关键点。在过去十几年中，支持介观神经环路研究的新方法和新技术取得迅速发展，比如光学钙成像和光遗传学技术，迅速成为神经环路科学研究的中流砥柱。光学钙成像能够以高采样密度记录大量遗传或解剖学定义的神经元细胞，并且可以随着时间推移在纵向跟踪单个神经元。这种强大的光学成像能力已在小鼠动物模型中取得巨大的成功，并促进脑神经科学家深入理解大脑基本功能而提出新的独特见解。然而，为了研究更复杂的或者与临床疾病相关的人类行为和认知过程中神经元活动和神经网络是如何发挥作用的，仍然迫切需要将这些新技术应用到与人类相关的大型动物模型物种上，即，大脑结构和功能以及复杂的认知和行为能力与人类高度相似的非人类灵长类动物物种上。

只有活的、在体的大脑才具备认知、学习、记忆等独特的高等智能功能，而死去、离体的大脑则不具备。因此，在活体大脑中以单个神经细胞精度观测和操控神经细胞活动信号的技术，构成了现代脑科学仪器技术的前沿主体。在诸多使用荧光标记物的高分辨光学显微成像技术之中，双光子成像技术具有天然的层析成像能力、亚微米级别的空间分辨率和毫秒级别的实时性，而且穿透深度可以达到近1mm，是当前动物在体神经活动信号研究的最佳方法之一。

最近，在非人类灵长类动物上，基于GCaMP系列荧光蛋白的双光子钙成像克服了一些技术上挑战。然而，绝大多数技术挑战的克服主要是基于台式双光子工作范式进行的，这种成像方式不可避免地还存在一些技术上的不足，包括:(1)透明玻璃窗口存在感染风险，随着时间推移，光学清晰度下降，成像周期缩短，需要日常维护；(2)为了维持长时间在一个稳定的视野内最终神经元活动信息，需要繁琐的显微镜校准；(3)无法对深度大于500μm的脑皮层、甚至大脑深度的脑回沟皮层或皮层下结构进行成像；(4)无法用单一激光扫描光束真正实现多个大脑区域的同时测量；(5)需要头部固定约束，从而限制了动物可执行的认知行为。

为了克服上述台式双光子成像方式在自由行为动物模型研究中存在的局限性，将双光子成像系统进行微型化和集成化，构建成为易拆装的头戴式光学成像系统是破解上述难题的关键。首先，头戴式微型光学成像探头非常适合自由行为活动动物神经活动研究，特别是大型的非人灵长类动物模型；其次，通过特殊的机械设计，可以在重复过程准确地对准同一个成像区域进行观察；最后，简易的安装、拆卸和日常维护，非常适合对同一区域长时间重复观察。典型的代表性研究成果是：2017年，北京大学程和平院士团队研制的微型化双光子显微镜FHIRM-TPM，目前的FHIRM-TPM2.0可以在视场420μm×420μm范围内，对自由活动小鼠实现了分辨率达亚微米级的神经元实时动态成像。然而，该方法仍然利用透明窗口对神经元活动进行观察，因此，其观察范围仍然无法超越脑皮层以下500μm的深度限制，无法实现对大脑深层神经元成像，目前，该技术方案仅成功应用于小鼠动物模型上，还未成功应用于非人灵长类动物模型的研究中。