[发明专利]一种大肠杆菌突变体的构建方法及外膜囊泡的制备方法有效
| 申请号： | 202111048805.X | 申请日： | 2021-09-08 |
| 公开（公告）号： | CN113755514B | 公开（公告）日： | 2023-06-16 |
| 发明（设计）人： | 沈锡辉;杨亚东;王瑶;孙宇;唐亚楠;肖志博 | 申请（专利权）人： | 西北农林科技大学 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N1/21;C12N1/20;A61K9/50;A61K47/46;C12R1/19 |
| 代理公司： | 西安恒泰知识产权代理事务所 61216 | 代理人： | 孙雅静 |
| 地址： | 712100 陕*** | 国省代码： | 陕西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 大肠杆菌 突变体 构建 方法 外膜囊泡 制备 | ||
1.一种大肠杆菌突变体的构建方法，其特征在于，敲除大肠杆菌的Tol-pal内膜系统蛋白和外膜磷脂积累相关蛋白；
Tol-pal内膜系统蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
外膜磷脂积累相关蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌突变体的构建方法，其特征在于，通过CRISPR-Cas9系统敲除大肠杆菌的Tol-pal内膜系统蛋白和外膜磷脂积累相关蛋白。
3.根据权利要求2所述的大肠杆菌突变体的构建方法，其特征在于，所述的CRISPR-Cas9系统是将携带Cas9蛋白的pCas温敏质粒导入大肠杆菌，将携带sg20以及目标基因上下游同源臂的重组敲除质粒pTargetF同时导入大肠杆菌，通过Cas9蛋白的切割以及目标基因上下游同源臂的同源重组交换，获得敲除目标基因的大肠杆菌突变体。
4.根据权利要求3所述的大肠杆菌突变体的构建方法，其特征在于，所述的pCas温敏质粒在50 mM L-arabinose诱导下表达Cas9蛋白，0.5mM Kmr的LB固体培养基上，30℃正常培养；
在37℃培养8-12 h消除pCas温敏质粒。
5.根据权利要求3所述的大肠杆菌突变体的构建方法，其特征在于，所述的重组敲除质粒pTargetF转录形成的sgRNA引导Cas9蛋白切割大肠杆菌染色体，通过同源重组替换断裂的DNA；
在0.25mM IPTG诱导下，Cas9蛋白对pTargetF的
6.根据权利要求1-5任一所述的大肠杆菌突变体的构建方法，其特征在于，编码Tol-pal内膜系统蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
编码外膜磷脂积累相关蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
7.一种大肠杆菌突变体，其特征在于，采用权利要求1-5任一所述的大肠杆菌突变体的构建方法获得。
8.一种外膜囊泡的制备方法，其特征在于，以权利要求7所述的大肠杆菌突变体为培养对象，于培养上清中提取外膜囊泡；
培养条件为：LB液体培养基37℃、200 r/min培养20～24 h。
9.根据权利要求8所述的外膜囊泡的制备方法，其特征在于，所述的培养上清分别应用8000 rpm离心5 min和6000 rpm离心15 min去除菌体；上清再通过分子截留和离心获得外膜囊泡。
10.一种外膜囊泡的制备方法，其特征在于，包括：（1）大肠杆菌突变体的构建：通过CRISPR-Cas9系统敲除大肠杆菌的Tol-pal内膜系统蛋白和外膜磷脂积累相关蛋白；Tol-pal内膜系统蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；外膜磷脂积累相关蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
（2）于（1）中得到的大肠杆菌突变体的培养上清中提取得到外膜囊泡：培养条件为：LB液体培养基37℃、200 r/min培养20～24 h。
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