[发明专利]一种从脂肪中分离提取冻存脂肪干细胞的方法

说明书

本发明公开了一种从脂肪中分离提取冻存脂肪干细胞的方法，其特征在于：包括以下操作步骤：将脂肪组织预处理成肉糜状脂肪颗粒，加入由胶原酶IV和胰蛋白酶组成的复合酶制剂后，在35‑38℃的温度条件下振荡15‑30min，收集细胞悬液，去掉细胞上清，即得脂肪干细胞。本申请中通过将脂肪组织处理成肉糜状脂肪颗粒，然后经过复合酶制剂的振荡消化15‑30min，处理成肉糜状脂肪颗粒，与复合酶制剂充分接触，从脂肪组织中快速分离提取出来。

技术领域

本发明涉及脂肪干细胞分离技术领域，具体地，涉及一种从脂肪中分离提取冻存脂肪干细胞的方法。

背景技术

脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)、ADSC多能细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。主要作用是：恢复组织细胞的修复功能，促进细胞的再生，恢复年轻面容的同时，身体机能也得到充分改善，有效改善亚健康、早衰等疾病，由内而外真正的有效抵抗衰老。

传统的脂肪移植手段由于存在免疫排斥、炎症反应等缺陷难以得到让人满意的疗效。据统计，自体脂肪组织移植到缺损部位后，通常其中40-60％会被吸收。通过患者自身的脂肪组织内的干细胞，来构建具有完整生物学结构和功能的脂肪组织无疑是解决这一问题的最佳方案。如何实现干细胞到脂肪细胞的分化，是构建脂肪组织不可回避的问题。早在2001年,Zuk等人发现脂肪干细胞以来，就已经证明脂肪干细胞具有向脂肪、软骨、成骨、成肌等多向分化潜能。

传统的成脂诱导分化采用方法是混合诱导剂法,用到成脂诱导剂具有一定毒性，对人体有较大的危害。

且现有的共培养方式主要采用体外诱导干细胞，而在培养过程中容易产生杂细胞，整个培养过程效率低下。

发明内容

为解决上述问题之一，本发明提供了一种从脂肪中分离提取冻存脂肪干细胞的方法，采用复合酶制剂对肉糜状脂肪颗粒进行充分振荡消化，提高脂肪干细胞的分离效率，从而解决了现有从脂肪中分离提取脂肪干细胞过程中，存在的培养效率低等技术问题。

一种从脂肪中分离提取冻存脂肪干细胞的方法，包括以下操作步骤：

将脂肪组织预处理成肉糜状脂肪颗粒，加入由胶原酶IV和胰蛋白酶组成的复合酶制剂后，在35-38℃的温度条件下振荡15-30min，收集细胞悬液，去掉细胞上清，即得脂肪干细胞。

本申请通过对脂肪干细胞的分离提取操作中，消化操作步骤进行创造性改进，采用复合酶制剂，在酶活性的作用下进行充分消化，以达到将脂肪干细胞从脂肪组织中充分分离。

其中，脂肪组织在采用复合酶制剂进行消化操作之前，需要将脂肪组织处理成肉糜状的脂肪颗粒，该处理操作可充分将脂肪干细胞和胶原酶裸露出来，从而增加脂肪干细胞与培养液的接触面积，促使脂肪干细胞的体外扩增。

在本申请中，肉糜状脂肪颗粒振荡消化温度是在35-38℃，此时酶活性最高，利于消化完全，且消化采用振荡消化的方式，消化时间仅需要15-30min，极大的提高了消化效率，也进一步加快了下一步脂肪干细胞的培养效率。

可选地，所述胶原酶IV的浓度为0.03％-0.05％，所述胰蛋白酶的浓度为0.3％-0.5％，所述胶原酶IV和所述胰蛋白酶按照体积比1:1混匀，即得复合酶制剂。

细胞间的物质主要是蛋白质和胶原纤维，胰蛋白酶又称胰酶，可以水解细胞间蛋白质，使细胞分散出来。胶原酶IV是唯一一种可以降解具有三股超螺旋结构的天然胶原纤维的蛋白酶，这种胶原纤维广泛存在结缔组织内。通过胶原酶IV水解细胞间质的胶原纤维使细胞游离出来。