[发明专利]一种急性肾损伤患者尿液细胞诱导多能干细胞的建立方法

说明书

本发明提出了一种急性肾损伤患者尿液细胞诱导多能干细胞的建立方法，包括如下步骤：步骤1、分离培养急性肾损伤患者的尿液肾脏细胞A，并分析细胞的染色体核型，以及免疫荧光鉴定肾脏特异性分子表达；步骤2、通过核转染技术将鼠源OCT4、SOX2、KLF4和c－MYC四个转录因子表达载体TetO－FUW－OSKM与激活表达载体FUW－M2rtTA转入尿液肾脏细胞A中，得到尿液肾脏细胞B；步骤3、对尿液肾脏细胞B进行培养，在尿液肾脏细胞B的培养液中加入盐酸多西环素进行诱导，建立尿液细胞诱导多能干细胞系，并对细胞系的多潜能分子进行免疫荧光鉴定，借此，本发明具有能够分离急性肾损伤患者的尿液肾脏细胞，并建立诱导多能干细胞的优点。

技术领域

本发明属于诱导多能干细胞的建立技术领域，特别涉及一种急性肾损伤患者尿液细胞诱导多能干细胞的建立方法。

背景技术

近几年，随着再生医学的发展，干细胞等相关技术在医疗领域中的研究与应用日益受到重视，而来源于成体细胞的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)系的建立，使得患者个体化医疗成为了可能，并为利用iPSCs救援肾损伤提供了新的思路。体外分离尿液细胞是目前非侵入性获得患者成体细胞的最佳途径。健康成人肾脏每天大约滤过100升体液，仅有2升随尿液正常排出，同时约2000－7000个脱落细胞存在于尿液中。而急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)后，肾脏则经历了早期的肾小管上皮细胞(tubular epithelial cells，TECs)损伤破坏过程和后期修复过程，而患者临床表现为损伤早期的少尿或者无尿，以及恢复期的尿量增多，同时尿沉渣中出现上皮样细胞。

自Takahashi和Yamanaka开创性的建立了iPSCs以来，来源于多种人体组织细胞的iPSCs均成功建系，其中包括肾脏组织，尤其是尿液来源的肾脏细胞。目前，尿液肾脏细胞主要来源于肾脏尚未发育完全的新生儿、早产儿以及胎儿，而肾脏发育成熟的儿童及成年个体尿液中获得肾脏细胞的效率极低，甚至无法获得。虽有报道从遗传性肾脏疾病患者尿液中分离细胞效率有所提高，但仍然很低。而在肾脏损伤修复过程中，患者尿液量逐步恢复，尿沉渣中各种细胞成分也不断增加，提示此时可能是从尿液中分离患者肾脏细胞的最佳时期，这些都为建立急性肾损伤患者尿液细胞诱导的多能干细胞提供了研究基础。

发明内容

本发明提出一种急性肾损伤患者尿液细胞诱导多能干细胞的建立方法，具有能够分离急性肾损伤患者的尿液肾脏细胞，并建立诱导多能干细胞的优点。

本发明的技术方案是这样实现的：一种急性肾损伤患者尿液细胞诱导多能干细胞的建立方法，包括如下步骤：

步骤1、分离培养急性肾损伤患者的尿液肾脏细胞A，并分析细胞的染色体核型，以及免疫荧光鉴定肾脏特异性分子表达；

步骤2、通过核转染技术将鼠源OCT4、SOX2、KLF4和c－MYC四个转录因子表达载体TetO－FUW－OSKM与激活表达载体FUW－M2rtTA转入尿液肾脏细胞A中，得到尿液肾脏细胞B；

步骤3、采用白血病抑制因子结合碱性成纤维细胞生长因子的培养系，对尿液肾脏细胞B进行培养，在尿液肾脏细胞B的培养液中加入盐酸多西环素进行诱导，建立尿液细胞诱导多能干细胞系，并对细胞系的多潜能分子进行免疫荧光鉴定。

作为一种优选的实施方式，分离培养急性肾损伤患者的尿液肾脏细胞A的方法包括如下步骤：

步骤1、利用无菌离心管收集急性肾损伤恢复期患者的晨尿30－50ml，于4℃低温存储；

步骤2、于4℃对步骤1中存储的晨尿进行低温离心，离心后获得尿液细胞管型，该离心条件为800g，15min；

步骤3、将尿液细胞管型接种于六孔培养板中，通过细胞培养液进行培养，培养24h后，将细胞培养液更换为尿液细胞培养液继续培养；