[发明专利]一种泛酸合成酶突变体、编码基因、载体及应用

说明书

本发明公开了一种泛酸合成酶突变体、编码基因、载体及应用，属于酶工程技术领域。本发明的泛酸合成酶突变体泛酸合成酶突变体，由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的泛酸合成酶的第5位和/或第176位氨基酸经定点突变获得。本发明通过多序列氨基酸比对，进行定点突变，提高泛酸合成酶的催化效率，进一步提高泛酸合成酶产量。本发明构建的泛酸合成酶的重组大肠杆菌可将泛酸合成酶酶活较出发菌株提高1.25倍。改造后的基因工程菌产酶能力显著提高，摇瓶发酵生产泛酸合成酶酶活达到144.266U/mL，更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。

技术领域

本发明涉及一种泛酸合成酶突变体、编码基因、载体及应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

D-泛酸（D-pantothenic acid）又称维生素B₅，是水溶性维生素B族的一种，是CoA和酰基载体蛋白ACP的重要前提，而根据KEGG数据库查阅，CoA参与的酶促反应达400多种，涉及脂肪酸代谢，细胞信号传递，三羧酸循环等中心代谢反应。天然泛酸具有右旋光性，即D-泛酸，是一种重要的食品添加剂和饲料添加剂，也是一种重要的维生素药物。临床上用于治疗维生素B缺乏症、周围神经炎、手术后肠梗阻、链霉素中毒及类风湿等疾病。

泛酸的商品形式主要为D-泛酸钙。自20世纪40年代起，世界上已开始研究泛酸钙的合成，60年代开始进行工业化生产。目前，世界年产量约20000吨，主要生产公司有浙江鑫富药业，新发药业，山东华辰，帝斯曼以及巴斯夫等，其中浙江鑫富生化股份有限公司D-泛酸钙年产量达7500吨，全球市场占有率达38.86%以上。中国在D-泛酸钙的生产能力占世界总生产能力的60%，其中用于饲料行业产品占据了94%，而对于医药级和食品级的D-泛酸钙仍然不能满足内需。

泛酸的合成有化学法和生物法。化学法主要采用stiller法，将异丁醛，氰化钠或者乙醛酸-异丁醛合成DL-泛解酸内脂，再将β-丙氨酸钙与DL-泛解酸内酯直接缩合获得DL-泛酸钙，然后拆分获得D-泛酸钙。由于化学法存在底物毒性以及拆分中生产成本高，生产量小，产品光学纯度差等问题，研究者仍然在寻找能产生泛酸生物合成过程中有用的酶或微生物系统。生物法合成泛酸主要是在生物体内，由α-酮异戊酸通过泛解酸羟甲基转移酶，通泛解酸还原酶，L-天冬氨酸-α-脱羧酶，泛酸合成酶（panC）的作用下生成泛酸。泛酸合成酶是泛酸合成的最后一步，是泛酸合成的关键酶之一，是将β-丙氨酸和泛解酸在ATP的参与下形成泛酸。1994年，Hikichi Yuichi等人开发了从葡萄糖生物合成D-泛解酸的大肠杆菌重组表达系统，表达大肠杆菌FV525泛酸合成酶的方法，仅添加β-丙氨酸，培养72h，直接发酵葡萄糖产生D-泛酸达65.4g/L。2005年，巴斯夫的专利CN02803857.6报道的用枯草芽孢杆菌表达系统通过表达来源于枯草芽孢杆菌的panBCD，panE1，panE2，ilvD，ilvBNC，glyA等基因生产泛酸，发酵48h产量达86g/L。以上均为大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌表达自身过着同种的泛酸合成酶，而对于异源表达的泛酸合成酶报道的较少，发酵时间较长。而目前的泛酸合成酶的研究报道主要集中在发展一下Mycobacterium tuberculosis泛酸合成酶结构，机理以及一下小分子抑制剂等，而对于其他来源的泛酸合成酶的报道却非常少。1978年，Kazutaka Miyatake等报道的来源于E.coliB的泛酸合成酶酶活2.05μmol/min/mg，1999年，Hermann Sahm报道的来源于谷氨酸棒状杆菌的酶活12nmol/min/mg蛋白，2008年，SilviaRonconi等报道的来源于Methanosarcina mazei的泛酸合成酶的酶活为0.14μmol/min/mg，报道的酶活都较低。

发明内容

为解决上述问题，本发明通过PCR定点定向突变得到催化活性提高的泛酸合成酶突变体，为其进一步的工业化应用奠定基础。

本发明采用的技术方案是：

一种泛酸合成酶突变体，由氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的泛酸合成酶（编码基因SEQ ID NO.5）的第5位和/或第176位氨基酸经定点突变获得。