[发明专利]一种发酵产他克莫司的筑波链霉菌株及其应用

说明书

本发明属于微生物领域，具体涉及一种发酵产他克莫司的筑波链霉菌株，并进一步公开其发酵产他克莫司的应用。本发明通过常压室温等离子体诱变技术筛选得到一株高产他克莫司的筑波链霉菌FIM‑Z‑A36(Streptomyces tsukubaensis)，其能够发酵高产他克莫司，在1T罐发酵实验中，所述筑波链霉菌FIM‑Z‑A36发酵产他克莫司的效价高达3138μg/mL，且发酵周期仅为128h，大幅度提高了他克莫司的产量并缩短了他克莫司的发酵周期，更加适宜于工业化发酵生产。而且，本发明筛选的菌株FIM‑Z‑A36稳定性良好，连续传代六代其产他克莫司效价基本稳定，维持在同一较高水平，能够作为进一步研究和开发的生产菌株。

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种发酵产他克莫司的筑波链霉菌株，并进一步公开其发酵产他克莫司的应用。

背景技术

大环内酯类免疫抑制剂是一类具有经体内外研究证明具有显著的免疫抑制作用的大环内酯结构的免疫抑制剂，可被用于治疗器官移植的排异反应和自身免疫相关性疾病等，其代表物质为他克莫司(Tacrolimus，FK506)、子囊霉素及其衍生物以及西罗莫司等。他克莫司是从Streptomyces tsukubaensis的发酵液中提取得到的一种含哌可酰基的23元大环内酯类化合物，具有免疫抑制药效强、用药剂量低、急性排异反应发生率低等优点，在器官移植和自身免疫系统疾病方面疗效显著。目前，他克莫司不仅是肝脏及肾脏移植后排斥反应的一线药物，还广泛应用于斑秃、牛皮癣、银屑病、类风湿性关节炎及多发性硬化病等自身免疫疾病的治疗,具有广阔的应用前景。他克莫司自从1984年首次发现以来，国内外已对其进行了大量的基础及临床研究。1998年他克莫司进入中国市场后，虽然市场份额迅速上升，但是当前进口原研药仍然占据80％左右的市场。

目前，国内微生物发酵法生产他克莫司的技术瓶颈主要是产率低、发酵水平较差或发酵周期较长。如中国专利CN107090477A公开的提高他克莫司产量的发酵方法，其通过在常规的他克莫司发酵过程中加入吸附树脂以及流加补充糊精，发酵170h后他克莫司含量可达1248mg/L，该工艺虽发酵水平较高，但发酵周期却较长，也导致生产成本仍然较高。又如中国专利CN105624068A公开的筑波链霉菌及其在制备他克莫司中的应用，主要是一种由筑波链霉菌HDW68发酵制备他克莫司中间体的方法，该发明提供的发酵工艺经1-20吨发酵罐的生产实践，证明其生产能力可达1100mg/L，但发酵周期却依然维持在6-7天，仍然存在发酵周期较长且培养基较为复杂的问题。又如中国专利CN105176904A公开的基因工程菌株筑波链霉菌L21及其应用，其通过基因工程提高他克莫司生物合成途径中的特异性调控基因的拷贝数，作为基因改造他克莫司生物合成途径中的限速酶以提高他克莫司的产量，将他克莫司的发酵单位提高至945mg/L，但基因工程菌株的稳定性有待进一步验证，该发明未详细给出进一步说明。再如中国专利CN109735467A公开的高产他克莫司的链霉菌诱变菌株及其应用，该发明提供的菌株Streptomyces tsukubaensis FIM-07-23在1吨发酵罐发酵132h，其发酵产他克莫司能力可达1522mg/L，虽然一定程度上提高了他克莫司的发酵水平，但仍期待更优的发酵能力。

基于常压室温等离子体育种技术(ARTP)是一种微生物基因组快速突变技术，其产生的等离子体富含各种化学活性粒子，对菌株细胞产生遗传物质的损伤、引起细胞膜通透性和蛋白质结构的改变等多重作用，细胞启动SOS修复机制，在修复过程中产生种类丰富的错配位点，突变率高；且微生物的抗性基因与产物合成基因呈紧密连锁分布，并可通过诱导表达，在很大程度上克服了诱变随机筛选的盲目性和不定向性，具有广谱性、正突变率和增产率高等特点。因此，通过采用ARTP诱变结合抗自身产物的抗性突变有望选择性提高菌株产物产量的阳性突变率，从而筛选到符合工业化生产他克莫司的高效菌株。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种发酵产他克莫司的筑波链霉菌株，以解决现有技术中他克莫司的发酵菌株性能不够理想的问题；

本发明所要解决的第二个技术问题在于提供上述筑波链霉菌株发酵生产他克莫司的应用。