[发明专利]一种核桃叶片内生生防细菌及其制备方法和应用

说明书

本发明属于微生物技术领域。一种核桃叶片内生生防细菌，所述核桃叶片内生生防细菌为耐冷假单胞杆菌（Pseudomonas psychrotolerans），所述核桃叶片内生生防细菌的保藏号为CGMCC No:22704，其16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明核桃叶片内生生防细菌安全性高，能够有效防治核桃炭疽病或层出镰刀菌引起的核桃叶枯病，生产使用成本低，无残留，安全性高，绿色环保，防治效果好。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种核桃叶片内生生防细菌及其制备方法和应用。

背景技术

核桃(Juglans regia)是我国重要的木本油料作物。由胶孢炭疽菌引起的炭疽病和层出镰刀菌引起的叶枯病侵染叶片会造成大面积叶片枯死，严重影响树体光合作用和树体营养的积累。目前对这两种病害的防治多集中在化学防治，本发明人在近期的研究中发现耐冷假单胞杆菌Pseudomonas psychrotolerans对层出镰刀菌和胶孢炭疽菌孢子萌发和菌丝生长具有显著的抑制作用，而该菌在在抗真菌活性在核桃叶部病害中未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种核桃叶片内生生防细菌及其制备方法和应用，该细菌安全性高，能够有效防治核桃炭疽病或层出镰刀菌引起的核桃叶枯病。

本发明的技术方案如下：

一种核桃叶片内生生防细菌，所述核桃叶片内生生防细菌为耐冷假单胞杆菌（Pseudomonas psychrotolerans）所述核桃叶片内生生防细菌的保藏号为CGMCC No:22704。所述核桃叶片内生生防细菌作为一种微生物，能够有效防治核桃炭疽病或层出镰刀菌引起的核桃叶枯病，无农药残留问题，安全性高。

一种核桃叶片内生生防细菌的制备方法，包括如下步骤：

S1.将核桃叶清洗除杂后进行表面消毒，在无菌研钵中研磨成匀浆；

S2.在匀浆中加入无菌生理盐水，取稀释液均匀涂布于无菌LB平板培养基上，重复多次后，于25-30℃的培养箱中倒置培养；

S3.待菌落长成后，选取大小、光泽、颜色、透明度、形状不同的单菌落，在无菌LB平板培养基上划线，于25-30℃的培养箱中倒置培养；

S4.观察菌落形态，继续挑选单菌落划线培养直至纯化。

进一步的，步骤S1中，表面消毒的具体操作为：用无菌水冲洗表面，无菌滤纸吸去水分，将叶片在75%的乙醇水溶液中浸泡5-10 s，晾干后浸入0.1%氯化钠溶液中表面消毒5-10 min，无菌水冲洗干净。

进一步的，所述LB平板培养基包括胰蛋白胨5-10 g、酵母粉5-10 g、氯化钠8-12g和琼脂18-20 g，蒸馏水定容至1000mL。

进一步的，步骤S2中，匀浆与生理盐水的体积比为1:9-10。

一种所述的核桃叶片内生生防细菌在制备防治核桃炭疽病或层出镰刀菌引起的核桃叶枯病的药物中的应用。

进一步的，所述防治核桃炭疽病或核桃叶枯病为拮抗核桃炭疽病的病原菌或层出镰刀菌。

一种药物制剂，包括所述的核桃叶片内生生防细菌。

进一步的，所述药物制剂为所述核桃叶片内生生防细菌的发酵液。

进一步的，所述药物制剂在使用时，所述核桃叶片内生生防细菌的使用浓度为1×10⁷CFU/mL-1×10⁹CFU/mL。