[发明专利]一种改造的空肠弯曲菌糖基转移酶、制备方法及应用

说明书

本发明提供了一种改造的空肠弯曲菌糖基转移酶、制备方法及应用，属于生物科技技术领域。通过去除空肠弯曲菌CgtB的氨基末端30个氨基酸和羧基末端前30个氨基酸,得到改造蛋白Cgt1；糖结合实验显示，原核表达的Cgt1突变体保持了结合O‑GalNAc类型修饰，对其他糖基化修饰并不结合。单糖封闭实验显示，经过GalNAc单糖孵育后，Cgt1的活性完全被抑制，因此本发明改造蛋白在识别和大规模鉴定O‑GalNAc修饰糖具有很大的应用潜力。

技术领域

本发明属于生物技术技术领域，涉及一种改造的空肠弯曲菌糖基转移酶、制备方法及应用。

背景技术

糖基转移酶是广泛存在于内质网和高尔基体内的一大类酶类，负责细胞内重要的活性物质如糖蛋白和糖脂中糖链的合成。其作用是把相应的活性供体(通常是二磷酸核苷NDP-糖)的单糖部分转移至糖、蛋白质、脂类和核酸等，完成后者的糖基化加工实现其生物学功能。目前已经发现了超过上百种糖基转移酶，合成了超过7000种复杂的糖结构，针对蛋白的糖基化修饰，又可以根据修饰的氨基酸和修饰的急湍可以将糖基化分化N-连接糖基化和O-连接糖基化修饰。

O-GalNAc(N-乙酰半乳糖胺)修饰是大多数O-连接糖基化修饰(除去O-GlcNAc修饰即N-乙酰葡萄糖胺，与GalNAc分子量相同，只有一个羟基的异位)的第一步修饰，主要发生在高尔基体内，有20多种糖基转移酶可以完成这一步，通过糖基转移酶ppGalNAc-Ts将底物UDP-GalNAc共价连接到蛋白的丝氨酸或苏氨酸上，首次发现于1969年。由于O-GalNAc修饰的合成酶只在高尔基体内有所报道，所以O-GalNAc修饰之前一直被认为合成起始于高尔基体中，以细胞内的分泌途径大部分分泌到细胞外，有部分存在于肿瘤细胞的表面，特别是一些mucin类型的糖蛋。但是最近有文章报道，在细胞核中同样发现了大量的O-GalNAc修饰的信号，并且在细胞核中成功鉴定到了ppGalNAc-T3糖基转移酶。通过糖组学研究，在细胞核和细胞质中都鉴定到了大量的O-连接糖基化修饰。这些都说明O-GalNAc修饰不仅仅修饰在分泌蛋白上，还可以修饰细胞核和细胞质的蛋白。

传统的观点认为O-GalNAc修饰主要发生分泌途径中，主要修饰的靶蛋白为分泌蛋白和膜蛋白。因此O-GalNAc修饰的功能研究目前主要集中膜蛋白和一些体液例如血清中的糖蛋白的功能，因为和肿瘤密切相关，O-GalNAc修饰也叫肿瘤相关抗原即Tn抗原。目前已经有几种Tn抗原阳性的糖蛋白例如黏蛋白CA15-3(MUC1)和CA125(MUC16)在临床上已经用于多种恶性肿瘤的诊断和预后跟踪，例如肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌和卵巢癌等，Tn抗原表达的上升一般预示着肿瘤恶性程度的增加和预后不良。在乳腺癌中，高表达的Tn抗原可以通过招募Galectin-3和MUC1使肿瘤细胞能够吸附在内皮细胞上，从而促进了肿瘤细胞的转移。然而Tn抗原在肿瘤发展中到底扮演着什么样的角色，目前仍然不是很清楚。

目前已经有很多工具用于去识别O-GalNAc修饰，其中凝集素仍然是广泛用于检测和结合O-GalNAc修饰的工具，例如凝集素VVL、TL2、MPL、DBA和Ricin等，这些凝集素大多来源于植物和真菌。这些报道识别O-GalNAc修饰的凝集素都是由二聚体或者四聚体通过非共价连接，特异性不专一，会结合其他的单糖例如galactose末端糖结构。综合而言，目前并没有一个对O-GalNAc修饰十分特异的凝集素，识别工具的缺乏也导致了对O-GalNAc修饰的研究十分困难。