[发明专利]一种牛支原体核酸检测胶体金免疫试纸条及其应用

说明书

本发明属于免疫学检测技术领域，尤其涉及一种牛支原体核酸检测胶体金免疫试纸条及其应用。本申请利用胶体金可以和抗体或生物素等标记的寡核苷酸相结合这一信号放大技术，提高检测灵敏度，构成可显色的检测探针，整合了PCR的特异性、敏感性和金标条快速、简单的特性，建立了M.bovis核酸检测的胶体金免疫试检测纸条，该方法的建立为临床微量牛支原体病原的检测研究提供了研究基础。

技术领域

本发明属于免疫学检测技术领域，尤其涉及一种牛支原体核酸检测胶体金免疫试纸条及其应用。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)是目前世界上对养牛业影响巨大且极易被忽视的新兴重要病原体微生物，可以引起牛肺炎、乳腺炎、中耳炎、生殖障碍、关节炎等多种混合感染的慢性疾病。目前对于对牛支原体疾病的致病机制和毒力因子的研究尚且处于初级阶段，缺少特异性药物、疫苗及快速诊断方法，并且M.bovis病在中国流行，造成巨大经济损失，已经成为养牛业健康发展的重大障碍，研制高效、快速、特异的检测方法对于加强对牛支原体的免疫和诊断监测愈发重要。

随着现代生物学技术的日趋成熟，目前的检测方法已经由从最开始的病原菌株分离培养，到现阶段血清学技术和分子生物学方法为主的转变。牛感染M.bovis后机体产生免疫应答性抗体，且这种反应通常在感染后持续一段时间，所以血清学检测成为一种有效的M.bovis诊断方法。在血清学检测中ELISA的应用较为常见，膜表面可变蛋白是M.bovis感染过程中宿主体液应答识别的主要抗原，基于VspA、VspB和VspC抗原包被的重组蛋白的间接ELISA具有较高的特异性和灵敏性。随着生物学技术的迅猛发展，荧光定量PCR环介导等温扩增技术在M.bovis的检测中也有着越来越广泛的应用。研究人员基于M.bovis的uvrC和P81等基因开发了一种SYBR Green的实时荧光PCR检测试剂盒，与其他相关细菌和其他支原体无交叉反应性，具有良好特异性，并且具有较高的敏感性。此外，基于uvrC和P81基因的环介导等温扩增技术检测已经被成功用于临床样本的检测，该检测方法具有灵敏度高、特异性强、检测快速准确等特点。快速诊断有助于M.bovis相关疾病的有效防控。分离培养法是病原检测的金标准，但周期较长，容易污染。血清学检测可能存在不同支原体之间的共同抗原，会导致交叉反应，造成假阳性。PCR方法其对检测人员的操作水平有较髙的要求且受仪器设备的限制较大。

生物素-亲和素系统(Bio-strept avidin，BAS)是目前自然界中发现的最强大的亲和材料，其亲和力至少比抗原抗体结合力高一百万倍。生物素系统被广泛应用于各种检测技术，适用于检测细菌、病毒、细胞、蛋白质和核酸的检测，不仅可以有效地提高目标相应配体分子的生物活性，结合效率和靶分子可显著提高，与检测信号级联反应，有效的提高了检测灵敏度，缩短检测时间，实现快速、灵敏的检测和生物分子的分析，用于生物和医学研究的检测带来新的想法。生物素系统逐渐成为一种类似ELISA的新兴酶联检测方法。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种牛支原体核酸检测胶体金免疫试纸条及其应用。目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种牛支原体核酸检测胶体金免疫试纸条，从下到上、由左至右依次包括PVC板、NC膜、上样垫、金标垫、样品垫、吸水垫，相互紧密贴合组成试纸条，将链霉亲和素和羊抗鼠IgG分别在NC膜上划出T、C线，将金标鼠抗地高辛IgG涂布在胶体金垫上，样品垫和吸水垫分别贴于试纸条的两端，将试纸条固定于塑料外壳内。

进一步，使用划膜仪按照1μL/cm的用量在NC膜上划出T、C线。

进一步，所用的链霉亲和素浓度为2mg/mL。

进一步，所用的羊抗鼠IgG的稀释比例为1:100。

进一步，所述金标鼠抗地高辛IgG在制备时，胶体金溶液的pH为8.5。