[发明专利]一种产丝氨酸乙酰转移酶的基因工程菌及其构建方法

说明书

本发明公开了一种产丝氨酸乙酰转移酶的基因工程菌及其构建方法，大肠杆菌cysE‑30，保藏于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M20211026。通过以下方法构建，(1)以非脱羧勒克氏菌YZ30的总DNA为模板，扩增出cysE基因，所述cysE基因序列如SEQ ID No.1所示；YZ30保藏于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M20211025；(2)将步骤(1)克隆得到的cysE基因与质粒载体连接，得到表达载体；(3)将步骤(2)得到的表达载体转入大肠杆菌中，筛选阳性克隆，即得。本发明的基因工程菌可以高效催化L‑丝氨酸生成O‑乙酰丝氨酸。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种产丝氨酸乙酰转移酶的基因工程菌及其构建方法。

背景技术

L-半胱氨酸可用于药物领域、化妆品工业以及食物领域，并且它还是构成谷胱甘肽、甲硫氨酸和生物素合成中的重要中间产物，具有十分重要的经济价值。L-半胱氨酸主要通过从含角蛋白物质(如头发、鬃毛、角、蹄以及羽毛)抽提或前体的酶促转化获得，收率低,能耗高, 水解过程会产生难闻气体及大量废酸,严重污染环境。目前，国际上制备L-半胱氨酸的热点研究方向主要集中于微生物法上，但微生物体内的L-半胱氨酸合成过程复杂,其中L-半胱氨酸的反馈抑制作用、硫源控制等是需要重点处理的问题。

在微生物中，大肠杆菌以L-丝氨酸和乙酰辅酶A为底物，通过由cysE基因编码的丝氨酸乙酰转移酶(SAT)催化，反应生成O-乙酰丝氨酸，然后被O-乙酰丝氨酸硫醇裂解酶(OASTL)催化生成L-半胱氨酸。而在大肠杆菌中高浓度的L-半胱氨酸对细胞有毒害性，所以当L-半胱氨酸积累浓度过大时，自身会通过反馈抑制作用降低丝氨酸乙酰转移酶的活性，从而减少中间产物O-乙酰丝氨酸的合成，以调节L-半胱氨酸浓度。

目前，根据微生物体内的代谢途径，通过两步法生产L-半胱氨酸比较普遍，但其首要问题是降低L-半胱氨酸反馈抑制丝氨酸乙酰转移酶的敏感性。目前实现的方法主要包括筛选L-半胱氨酸营养缺陷型菌株，以提高反馈抗性；定点突变使丝氨酸乙酰转移酶的蛋白质序列中的氨基酸改变或缺失，降低敏感性；比较多个异源的cysE基因，寻找最优的候选者等。通过这些方法，在一定程度上提高了L-半胱氨酸的产量。

在实际工业生产中，两步法还面临着诸多问题。在对基因的改造上就包括上述的降低乙酰丝氨酸转移酶的敏感度、转运基因的改造、前体基因的过量表达改造和敲除分解L-半胱氨酸和L-丝氨酸的基因等，其研发难度大，投入资金高，而产量提升效果有限。除此之外，在发酵运行中，对菌体生长情况的掌控直接影响投料比例，特别是在第二步加入硫源，易对设备产生腐蚀性，这就对发酵和探测设备提出较高的精度和质量要求，加大了生产成本，而且由于硫源物质的存在，影响周边生态环境，后续需要专业设备处理废水、废气，进一步增加了生产成本。鉴于这些研发困难和实际生产问题，寻找更佳的生产方法显得十分必要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何构建一种高效表达丝氨酸乙酰转移酶的工程菌，以实现体外高效催化L-丝氨酸生成O-乙酰丝氨酸。

本发明的技术方案为：一株产丝氨酸乙酰转移酶的基因工程大肠杆菌(Escherichia coli) cysE-30，于2021年08月13日保藏在武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 20211026。

本发明的基因工程大肠杆菌(Escherichia coli)cysE-30在催化L-丝氨酸生成O-乙酰丝氨酸上的应用。

一种产丝氨酸乙酰转移酶的基因工程菌，所述基因工程菌为大肠杆菌，导入了SEQID No.1所示丝氨酸乙酰转移酶基因。

进一步地，所述基因工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

一种构建上述产丝氨酸乙酰转移酶的基因工程菌的方法，包括以下步骤：