[发明专利]核酸检测试剂盒、反应体系及方法

权利要求书

1.一种核酸检测方法，其特征在于，其包括以下步骤：

(1)提供环状单链DNA分子模板的步骤；

(2)使待检测的核酸打断得到的片段或根据待检测的核酸设计的引物作为一次引物，然后在含有链置换酶和dUTP的反应溶液中进行第一恒温滚环扩增得到扩增产物的步骤；

(3)通过切刻酶将所述扩增产物切割为适于作为二次引物片段的步骤；和

(4)在足以使切刻酶失活的温度下进行第二恒温滚环扩增的步骤。

2.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述反应溶液进一步包含dTTP，且dUTP与dTTP的摩尔比为1:3-10。

3.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述二次引物的长度为20-50bp。

4.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述第一恒温滚环扩增的温度为50-70℃，和/或所述足以使切刻酶失活的温度为50-70℃。

5.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述环状单链DNA分子通过下述方法制备：

a.单链DNA设计合成，得到具有特定序列的单链DNA，将所述单链DNA进行5’端磷酸化修饰得到经磷酸化修饰的单链DNA；

b.将所述经磷酸化修饰的单链DNA经环化连接酶环化扩增后得到环状单链DNA分子。

6.根据权利要求5所述的核酸检测方法，其特征在于，所述核酸为RNA和/或单链DNA。

7.根据权利要求6所述的核酸检测方法，其特征在于，所述RNA包括真核生物RNA、原核生物RNA和病毒RNA。

8.一种用于核酸检测的试剂盒，其特征在于，其包含环状单链DNA分子、切刻酶、链置换酶和三磷酸脱氧核苷混合物，其中所述三磷酸脱氧核苷混合物包含dTTP、dUTP、dCTP、dGTP和dATP，且dUTP与dTTP的摩尔比为1:3-10。

9.根据权利要求8所述的用于核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述环状单链DNA分子和三磷酸脱氧核苷混合物以溶解于同一缓冲液的方式设置，所述切刻酶和链置换酶分别以单独存放方式设置。

10.一种用于核酸检测的反应体系，其特征在于，其包含缓冲液和溶解于所述缓冲液的环状单链DNA分子、链置换酶和三磷酸脱氧核苷混合物，其中三磷酸脱氧核苷混合物包含dTTP、dUTP、dCTP、dGTP和dATP，且dUTP与dTTP的摩尔比为1:3-10。