[发明专利]一种过氧化氢酶活性包涵体与应用

说明书

本发明公开了一种过氧化氢酶活性包涵体与应用，属于生物技术领域。所述过氧化氢酶活性包涵体的制备方法包括：(1)构建含有KatA‑linker‑TdoT融合蛋白的编码基因的重组表达载体，将该重组表达载体转入表达宿主细胞，获得重组工程菌；(2)培养所述重组工程菌，诱导外源重组蛋白表达；(3)收集菌体细胞并进行细胞破碎，分离细胞破碎上清液和含有包涵体的沉淀样品，将沉淀样品通过缓冲液洗涤法纯化得到活性包涵体。通过该方法制备得到过氧化氢酶活性包涵体表达量大、易分离纯化、可重复利用、环保安全，有利于促进生物酶催化法在工业中去除残留过氧化氢中的应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种利用卷曲螺旋结构域TdoT作为融合标签制备过氧化氢酶活性包涵体与应用。

背景技术

过氧化氢作为氧化剂、漂白剂、消毒剂、脱氧剂、聚合物引发剂和交联剂，已在化工、纺织、造纸、军工、电子、医药、环境保护和食品等领域中得到了广泛应用。如在纺织工业中，通常在50℃以上高温和碱性溶液中(pH 9及以上)使用过氧化氢对织物进行漂白。由于残留的过氧化氢会严重影响织物的染色，造成染色不充分、色泽不均匀、批次间色泽差异较大等问题，同时废水中残留的过氧化氢也会带来严重的环境污染，因此去除织物和漂白用水中残留的过氧化氢至关重要。

目前去除过氧化氢的方法主要包括传统的水洗法和化学还原剂法，以及生物酶催化法。其中，水洗法不仅需要消耗大量水及能源，而且去除过氧化氢不彻底。化学还原剂法主要使用如保险粉、大苏打等试剂去除过氧化氢。但是，由于该法难以精确评估试剂的加入量，不仅带来了活性染料被添加剂还原分解的风险，同时会产生高盐废水。综上所述，传统过氧化氢去除方法存在去除效率低、能耗高、可控性差、带来额外污染物等缺点，而生物酶催化法主要采用过氧化氢酶分解去除过氧化氢。过氧化氢酶(Catalase，简称CAT，EC1.11.1.6)能够催化H₂O₂分解生成O₂和H₂O。过氧化氢酶存在于大多数动植物和微生物体内，可以降解过氧化氢使细胞免受氧化损伤，同时可用于工业中分解去除过氧化氢。相比传统的过氧化氢去除方法，生物催化法具有去除效率高、能耗低、易控制、环保安全等优势。当前工业中对过氧化氢酶的需求量较大，但天然过氧化氢酶产量低，游离过氧化氢酶难以回收再利用，并且一些过氧化氢酶在碱性溶液环境下易失活，造成过氧化氢酶相关的生产和使用成本较高，这限制了其实际应用。选取具有优良催化性能的过氧化氢酶进行异源表达，同时结合酶固定化技术能够提高其重复利用率，降低工业生产和使用成本。利用原核生物异源表达重组蛋白经常容易形成不溶性包涵体。近年来对于包涵体结构和功能活性的研究进展表明，将一些重组蛋白与特定标签序列融合表达，能够在包涵体中形成正确折叠的构象，从而表现出功能活性，被称为活性包涵体。由于将酶蛋白表达为活性包涵体是一种稳定可重复利用的固定化酶，无需载体材料和额外的固定化反应，并且表达和固定化同步进行，可以通过离心方便的回收再利用，因此表现出巨大的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用卷曲螺旋结构域TdoT作为融合标签制备过氧化氢酶活性包涵体的方法，从而解决纺织工业中过氧化氢酶生产和使用成本高等问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明的第二方面，提供一种上述基因编码的含有KatA-linker-TdoT的融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

根据本发明的第三方面，提供一种含有上述基因的重组工程菌。

根据本发明的第四方面，提供一种过氧化氢酶活性包涵体，由所述重组工程菌诱导融合蛋白表达，菌体破碎、分离、纯化所得。

具体地，所述过氧化氢酶活性包涵体的制备方法，包括以下步骤：利用卷曲螺旋结构域TdoT作为融合标签将过氧化氢酶KatA制备成活性包涵体，具体包括以下步骤：