[发明专利]一种发酵罐生产两性霉素B的分批补料发酵方法在审

专利信息
申请号: 202111085830.5 申请日: 2021-09-16
公开(公告)号: CN113832205A 公开(公告)日: 2021-12-24
发明(设计)人: 柳志强;张博;郭一平;杨晓章;党万利;吴哲明;黄良刚;周俊平;郑裕国 申请(专利权)人: 浙江工业大学;浙江天台药业股份有限公司
主分类号: C12P19/62 分类号: C12P19/62;C12Q3/00;C12N1/20;C12R1/465
代理公司: 浙江千克知识产权代理有限公司 33246 代理人: 冷红梅
地址: 310014 浙*** 国省代码: 浙江;33
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摘要:
搜索关键词: 一种 发酵 生产 两性 霉素 分批 方法
【说明书】:

发明涉及一种发酵罐生产两性霉素B的分批补料发酵方法。本发明分阶段发酵调控策略能够提供结节链霉菌一个最佳的菌体生长和产物合成的外部环境,有利于两性霉素B的积累;采用本发明发酵方法,两性霉素B在温度在31℃,发酵溶氧维持在20%,发酵液残糖控制在0.5~1%时,最终两性霉素B在50吨发酵罐中产量为14g/l左右。

(一)技术领域

本发明涉及一种发酵罐生产两性霉素B的分批补料发酵方法。

(二)背景技术

两性霉素B(AmphotericinB,AmB)是重要的抗真菌类抗生素,自1966年上市以来,一直是深部真菌感染的首选药物。AmB纯品的颜色为黄色或橘黄色,由于其分子结构中亲水基团与疏水基团的不对称分布和带有酸碱性的特点,使得AmB在水相及大部分有机相中的溶解度极低。AmB抗真菌谱广、活性强,对念珠菌、隐球菌、毛霉菌、曲霉菌、组织胞浆菌、球孢子菌等大多数深部真菌都有很强的抗真菌作用,还能有效抑制假丝酵母菌和用于治疗利什曼病等,因此两性霉素B及其衍生物的应用仍然非常广泛。

目前两性霉素B的工业生产仍主要采用的是微生物发酵法,微生物发酵生产抗生素的水平高低除了与菌种遗传特性有关,还与发酵培养基成分和发酵条件及发酵过程控制有关。对于前者目前有诱变育种和分子改造等手段,对于后者主要通过优化得到最适发酵培养基配方、发酵培养条件。目前,两性霉素B仍存在产量较低,产业化生产发展缓慢的问题限制了两性霉素B的发展,对其进行扩大培养的条件进行优化,尤其是大型发酵罐发酵工艺条件的优化对于工业生产具有非常重要的意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种提高大肠杆菌L-半胱氨酸合成量的发酵方法。

本发明采用的技术方法是:

一种发酵罐生产两性霉素B的分批补料发酵方法,所述方法为:将结节链霉菌接种至种子培养基,获得种子液;种子液接种至发酵培养基,进行发酵培养,发酵总时间120±36小时,发酵过程中参数控制如下:

(1)控制发酵体系pH维持在6.5~7.8,直至发酵结束;

(2)在发酵培养第0~36h,维持温度在31±2℃,当发酵至36h时,将温度降至26±2℃,维持该温度直至发酵结束;

(3)发酵前期使菌体在自然DO条件下生长,当发酵体系DO值下降至20%~30%时,控制DO值维持在大于20%直至发酵结束;

控制发酵培养基中葡萄糖浓度,发酵过程中浓度下降到1%~2%时,进行恒速补料,控制葡萄糖含量为0.5%~1%至发酵结束。每隔12h对残糖浓度进行实时检测,根据残糖浓度来补加液糖。

本发明通过对于两性霉素B在发酵罐中的发酵工艺进行优化,可以了解两性霉素B在扩大培养过程中可能中存在的问题,补料可以解除底物抑制、产物反馈抑制和分解代谢物的阻遏;可以避免在分批发酵中因一次投料过多造成细胞大量生长所引起的影响,改善发酵流变学的性质;可用作控制细胞质量的手段,以提高发芽孢子的比例。葡萄糖的流加调节,避免了葡萄糖在整个发酵过程中浓度不均一,以及一次性补入大量葡萄糖,不利于菌体的生长代谢的问题。此外糖高会产生酸性物质,如乳酸等,造成菌体不长,pH下降;糖低营养不足,造成菌体不长。菌体不长或生长缓慢将会打破两性霉素B生物合成过程中的正常代谢途径,同时造成pH变化,最终形成更多复杂的副产物,不利于后期的分离纯化。通过本发明的补料控制方法,可以保证发酵液中葡萄糖的相对稳定浓度,使得菌体生长的各个阶段都可以保持最佳生产状态,有效提高两性霉素B的产率。

优选的,所述结节链霉菌为结节链霉菌CCTCC NO.M 2017426,已在CN110564718A中披露。

具体的,所述发酵罐容量为500L~10000L。

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