[发明专利]一种双靶向DNA纳米载药复合体的建立及合成方法

说明书

本发明公开了一种双靶向DNA纳米载药复合体的建立及合成方法，该载药复合体是以一条Aptamer1和一条天然AS1411或化学修饰AS1411以碱基互补配对的方式同时连接到DNA四面体上，分别得到DNA四面体‑Aptamer1‑AS1411、DNA四面体‑Aptamer1‑AS1411‑1、DNA四面体‑Aptamer1‑AS1411‑2、DNA四面体‑Aptamer1‑AS1411‑3。本发明将该载药复合体应用于制备治疗黑色素瘤的药物上。本发明构建了四种基于CD44和核仁素核酸适配体的双靶向DNA纳米载药系统，与单靶向载药复合体和阴性对照组相比，四种双靶向载药复合体具有更强的耐核酸酶降解能力、靶向黑色素瘤A375细胞的能力、抑制A375细胞增殖的能力和诱导A375细胞发生G1期阻滞的能力。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种双靶向DNA纳米载药复合体的建立及合成方法。

背景技术

黑色素瘤(Malignant melanoma)是人类皮肤肿瘤中恶性程度较高的一种，近年来，黑色素瘤的发病率持续增加，并呈年轻化的趋势。虽然免疫治疗和分子靶向治疗的最新进展为黑色素瘤提供了一些更为有效的治疗方式，但这些治疗方法仍然不能完全解决药物的毒副作用这个难题。因此，研发新的针对黑色素瘤的靶向治疗方法，降低化疗药物的毒副作用，对于提高黑色素瘤治疗的总体疗效至关重要。

CD44分子是一类跨膜单链糖蛋白，它通过介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的信号传导来调控细胞的多种生物功能。研究发现，CD44在多种肿瘤细胞表面过表达并与肿瘤的发生发展及侵袭转移密切相关。由于CD44基因在表达过程中有外显子选择性剪接和多种翻译后修饰(如糖基化修饰)现象存在，导致CD44基因产物呈现多结构和多功能化特征，其中在肿瘤细胞中特异性表达的CD44变体与肿瘤的恶性行为密切相关。鉴于在肿瘤细胞和正常细胞表面的CD44存在结构和功能上的差异，特异性靶向肿瘤细胞表面CD44的生物分子可望在肿瘤靶向治疗和药物靶向递送中发挥重要作用。

目前，最有效的靶向CD44的抗肿瘤策略是以抗CD44抗体作为靶向分子的抗体耦联药物。然而，各种强烈的毒副作用导致临床实验均被叫停。此外，CD44的天然配体是透明质酸(HA)，已有大量研究工作利用HA靶向识别肿瘤细胞表面的CD44分子，研发肿瘤靶向治疗方法。然而，肿瘤细胞可分泌大量HA，形成“糖外衣”，使药物难以穿透肿瘤细胞间质，不能顺利到达肿瘤细胞。而且，HA和CD44的相互作用掩蔽了CD44靶点的裸露，减低靶向药物的杀伤效果。

核酸适配体是一段单链DNA或RNA分子，具有特定的三维构象，能高亲和力的识别靶标分子，是理想的靶向识别分子。虽然核酸适配体作为靶向分子已经展现出了巨大的应用前景，但是还存在很大的优化空间。为了进一步改善核酸适配体的理化性质以增加它与靶标的亲和力和特异性，通常需要对核酸适配体序列进行合理的化学修饰，如将寡聚核酸链中戊糖环的2’位H用-NH2、-OCH3、-F等取代，将正常的碱基用锁核苷等结构取代，或将磷酸二酯键修饰为硫代磷酸二酯键等。近年研究发现，通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选获得的硫代修饰的DNA核酸适配体能够特异性识别肿瘤细胞表面的CD44分子。与CD44抗体和HA相比，CD44核酸适配体具有肿瘤细胞间质穿透能力和靶标亲和力，又不会导致强烈的免疫反应，是更为理想的靶向分子。

核仁素是一种蛋白分子，高度保守，主要由N端、中心区域和C端三个不同的结构域组成，不同结构域发挥不同的生物学功能。其中，N端参与调节蛋白与蛋白之间的相互作用和细胞周期等；中心区域提供RNA等核酸的识别结合位点等；C端功能上以帮助较大RNA定位为主。有研究表明，在正常细胞膜表面核仁素表达量很少，而在黑色素瘤、Hela(宫颈癌细胞)、乳腺癌细胞、肝癌细胞、淋巴瘤细胞等多种肿瘤细胞膜表面核仁素过表达，而且，核仁素可以将抗肿瘤药物分子从细胞表面转运到细胞核。因此，针对核仁素的抗肿瘤靶向治疗一直是靶向治疗领域的研究热点。