[发明专利]一种链霉菌胰蛋白酶特异性改造的方法及其应用

权利要求书

1.胰蛋白酶突变体，其特征在于，以SEQ ID NO.1所示氨基酸序列为亲本序列，将其第167位取代成丙氨酸或丝氨酸。

2.编码权利要求1所述突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的载体。

4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体包括但不限于pPIC9K、pPIC3K、pET系列载体、Duet系列、pGEX系列。

5.含有权利要求2所述基因或权利要求3或4所述载体的微生物细胞。

6.根据权利要求5所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞包括但不限于大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌。

7.一种生产胰蛋白酶突变体的方法，其特征在于，利用权利要求5或6所述微生物细胞发酵生产胰蛋白酶突变体。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将所述微生物细胞在BMGY培养基中培养至OD₆₀₀为4-6，收集菌体转接至新鲜的BMGY培养基，在发酵初始时及每隔20～24h按培养基体积的0.5～1％加入甲醇诱导表达，在28～30℃、700～750rpm培养不少于96h。

9.一种生产胰岛素的方法，其特征在于，以胰岛素前体为底物，将权利要求1所述胰蛋白酶突变体按不少于1000U/mg底物的量添加至反应体系中，在23～25℃下水解18～20小时结束反应。

10.权利要求1所述胰蛋白酶突变体或权利要求2所述基因或权利要求5或6所述微生物细胞在生产胰岛素或胰岛素类似物中的应用。