[发明专利]一种海葡萄组织培养方法

权利要求书

1.一种海葡萄Coccoloba uvifera组织培养方法，其特征在于：

包括如下步骤：

（1）获得外植体顶芽及带节茎段并杀菌消毒；

（2）外植体接种；

接种培养基成分包含MS、浓度为0.5mg/L BA、浓度为0.01mg/L NAA、浓度为30g/L蔗糖和浓度为5.5g/L卡拉胶，pH为6.2；

（3）萌芽后进入启动诱导培养，得到组培苗；

启动诱导培养基成分包含：MS、浓度为0.5mg/L BA、浓度为0.01mg/L NAA、浓度为30g/L蔗糖和浓度为5.5g/L卡拉胶，pH为6.2；

（4）启动诱导得到的组培苗增殖率稳定，团块苗芽数稳定，进入增殖扩繁期，首先采用增殖扩繁培养基1培养；随着代数的增加后出现叶片小而畸形、泡沫状愈伤组织偏多，增殖苗节间短且芽少的情况，或出现苗玻璃化、泡沫愈伤组织增多/畸形情形，需转到BA浓度比增殖扩繁培养基1低的增殖扩繁培养基2培养；

增殖扩繁培养基1成分包含：MS、浓度为0.3mg/L BA、浓度为0.01mg/L NAA、浓度为30g/L蔗糖和浓度为5.5g/L卡拉胶，pH为6.2；

增殖扩繁培养基2成分包含：MS、浓度为0.1mg/L BA、浓度为0.01mg/L NAA、浓度为30g/L蔗糖和浓度为5.5g/L卡拉胶，pH为6.2；

（5）把增殖扩繁后得到的增殖苗进行壮苗成苗培养，壮苗成苗培养后达到出货标准的生根苗直接装袋出货，株高未达标的继续壮苗成苗培养，达出货标准但未出货的苗或株高达标但未生根的苗转移到生根诱导培养基进行生根培养；

壮苗成苗培养基成分包含：1/4MS、浓度为0.2 g/L AC、浓度为30g/L蔗糖和浓度为5.5g/L卡拉胶，pH为6.2；

（6）生根诱导培养，生根诱导培养基成分包含：1/2 MS、浓度为0.7~1.5 mg/L NAA 、浓度为30g/L蔗糖和浓度为5.5g/L卡拉胶，pH为6.2。

2.根据权利要求1所述的一种海葡萄Coccoloba uvifera组织培养方法，其特征在于：

所述步骤（1）获得外植体的过程包括：预处理，清理掉累积在母本茎叶的灰尘，将母本茎叶控干，让太阳光紫外线进行消毒，选取表皮依旧绿色的当年生枝条，切取较干净、性状良好、健壮枝条，剪去多余叶片；细处理，环割枝条上的托叶鞘，注意不要损伤茎干，将枝条切成单个节，每个节上下各留1cm节间部分；整个过程注意保持干净，细处理后的外植体标准，要求茎段洁净，茎干不割伤，除非虫蛀、腐烂不得已必须割去，割去托叶鞘的节上不沾有灰尘；

外植体杀菌消毒过程包括：先用75%酒精擦拭外植体表面，再倒入备用好的升汞到外植体材料瓶中，升汞液位必须淹没外植体，旋紧瓶盖；在升汞消毒过程中，每隔 2-3 分钟用力摇动外植体瓶，使外植体和瓶内壁充分被升汞消毒彻底，每次快速摇动 7-8 次后，将外植体瓶轮流正放和倒放；如果升汞溶液出现变色或浑浊时，当升汞消毒时间到目标时间一半时，倒出废升汞到一个装废升汞的瓶子中，然后新加入新升汞到淹没外植体液位为止，盖紧外植体瓶盖继续消毒，方法如上；如果升汞溶液不出现变色或浑浊，就不需中途更换升汞；

无菌水清洁：当升汞消毒结束后，取一个无菌水瓶打开盖子倾倒出无菌水到外植体材料瓶中，左手握住外植体材料瓶下部轻轻摇动清洗外植体和瓶内壁，摇动7-8次，倒出清洗后的无菌水到一个空广口瓶中存放，然后再打开第二瓶无菌水盖子继续清洁，如此清洁5-6次后便消毒完毕；

消毒时间：0.1%升汞消毒8-12min。

3.根据权利要求1所述的一种海葡萄Coccoloba uvifera组织培养方法，其特征在于：

所述步骤（2）接种过程包括：切去外植体因升汞消毒造成的伤口，顶芽和带节茎段均切成1cm长，然后夹住外植体形态上部将外植体形态下部插入到接种培养基中，插入培养基深度至少3mm，使外植体不倒伏，每瓶接种一个外植体；把培养基置于26-30℃条件下，散光培养45～60天后，外植体萌芽。