[发明专利]基于分子对接的PAP的高特异性的偶联酶YND突变体、方法和应用

权利要求书

1.一种基于分子对接的3’,5’-二磷酸腺苷的高特异性的偶联酶YND突变体，其特征在于：所述YND突变体的基因序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4，所述YND突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8。

2.根据权利要求1所述的基于分子对接的3’,5’-二磷酸腺苷的高特异性的偶联酶YND突变体，其特征在于：分子对接软件Vina¹被用于设计对PAP底物具有较高特异性的YND，YND的三维结构使用PDB ID为1K9Y²的蛋白质结构；YND的突变体使用Discovery StudioVisualizer构建；底物PAP和PAPS均使用ChemDraw绘制；在对接研究中，格点间距被设为同时其格点中心(x，y，z)为(9.623，16.925，-23.414)，格点参数设为对接所得构象数为20。

3.根据权利要求1所述的基于分子对接的3’,5’-二磷酸腺苷的高特异性的偶联酶YND突变体，其特征在于：所述YND突变体由大肠杆菌表达系统诱导表达。

4.根据权利要求1至3任一项所述的基于分子对接的3’,5’-二磷酸腺苷的高特异性的偶联酶YND突变体，其特征在于：所述YND突变体储存于储存液中，-80℃条件下，能维持活性3个月，用相应的缓冲体系稀释使用。

5.如权利要求1至4任一项所述的基于分子对接的3’,5’-二磷酸腺苷的高特异性的偶联酶YND突变体在磺酰基转移酶测定方面中的应用。

6.如权利要求1至4任一项所述的基于分子对接的3’,5’-二磷酸腺苷的高特异性的偶联酶YND突变体的制备方法，其特征在于：步骤如下：

首先对NCBI获得的YND基因进行设计，在基因两端插入XhoI、NcoI酶切位点，检查并利用密码子的兼并性去掉位于基因上存在的XhoI、NcoI酶切位点，修改后的氨基酸序列为SEQID NO.5，基因序列为SEQ ID NO.1；

通过人工合成基因的方法合成修饰后的YND基因，将获得的YND基因与经过XhoI、NcoI限制性核酸内切酶酶切后的PET28a(+)线性载体，利用solution I连接酶进行连接，构建表达载体用于表达YND；

利用重叠PCR的方法获得突变DNA，根据YND的序列与分子对接获得的需要突变的位点，设计定点突变PCR引物，以突变位点为中心，选取含突变后碱基的同源序列15-25bp，并向上游与下游选取17-30bp碱基作为引物，设计引物序列为SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.16；

将构建后的突变质粒化转E coli JM109感受态细胞进行扩增并对其进行测序验证；

将测序成功的突变质粒化转E coli BL21，挑取化转后的单菌落于5mLLB培养基试管中过夜培养，将获得的菌液接种到1L三角瓶液体培养基中进行液体培养，37℃培养至OD₆₀₀到0.6，加入IPTG置于16℃摇床中进行诱导表达；20h后收集菌体；

取裂解液悬浮菌体，冰浴超声破碎菌体，12000rpm,30min，收集上清；

通过镍柱亲和层析的方法进行目的蛋白的纯化，用储存液对镍柱亲和层析获得的蛋白进行超滤，置换其缓冲体系，即得YND突变体，-80℃保存；

其中，所述储存液为50Mm Hepes缓冲液，pH7.5。

7.根据权利要求6所述的基于分子对接的3’,5’-二磷酸腺苷的高特异性的偶联酶YND突变体的制备方法，其特征在于：所述YND为酵母3’,5’-二磷酸腺苷酶，www.pdb.org；PDB:1KA1。