[发明专利]一种用于灵长类动物神经元分离的试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种用于灵长类动物神经元分离的试剂盒及方法，涉及生物细胞技术领域。本发明的试剂盒通过对人工脑脊液和脑组织修复液的配方进行优化，在人工脑脊液中添加了抑制剂混合物，提高神经元的存活率，降低神经毒性，更适合灵长类动物脑细胞的分离。本发明的试剂盒首次成功分离出灵长类动物单个神经元且能保证90％以上的神经元的存活，并能够保留神经元的胞体、树突、轴突和其他突起等，实现灵长类动物单个神经元几乎所有信息的检测，更深入地了解不同神经元的异质性，探究神经元更全面更完整的信息。

技术领域

本发明涉及生物细胞技术领域，具体涉及一种用于灵长类动物神经元分离的试剂盒及方法。

背景技术

近几年来，各种单细胞技术开始迅猛发展。人们通过裂解匀浆新鲜或冷冻的组织和细胞后，最后通过分离纯化等获得单细胞或者单细胞核，应用于各种单细胞技术来探索细胞的发育、细胞类型和状态、人类疾病和干细胞技术的发展。单细胞核分离技术能够获取取材困难的组织、难以分离单细胞的组织或者冰冻组织的单个细胞核，但是丢失细胞质的信息如遗传物质和蛋白质等。单细胞分离技术能够获取新鲜组织的单个细胞，但是在有些情况下，细胞是很难完整分离的，如灵长类神经系统的神经元，在分离细胞时所用的酶和机械力往往会破坏神经元的完整性，分离的细胞活性很低。因此，目前单细胞技术对神经元的研究倾向于单细胞核的分离。但是由于神经元结构的特殊性，神经元胞体、树突及突触内包含有大量遗传物质和蛋白质等，因此灵长类神经元的分离就显得特别重要。

中枢神经系统的细胞一直处于研究阶段，部分原因是很难分离到完整的细胞。由于脑组织的特异性，脑组织中含有丰富的神经纤维和髓鞘，且神经元的轴突和树突相互连接，蛋白酶倾向于将易解离的细胞解离出来，但是不易解离的细胞就会丢失。脑组织中的一些较为敏感的神经元可能会因为解离过度、兴奋毒性、缺氧等原因而破碎。探索灵长类动物神经元分离技术，对于研究灵长类动物罕见的神经元细胞类型、绘制神经元发育轨迹图谱、神经干细胞的分化谱系、神经元的特征与功能、深入理解人类大脑发育的规律和了解人类疾病的发生发展等至关重要。由于脑组织的特殊结构，目前还没有针对成年灵长类动物神经元分离的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种灵长类动物神经元分离试剂盒及方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种人工脑脊液包含：60~65mMNaCl，10~15mM NaHCO₃，0.4~0.6mM NaH₂PO₄，0.9~1.1mM KCl，11~14mM D-葡萄糖，0.9~1.1mMCaCl₂，0.4~0.6mM MgCl₂，2~3mM L-抗坏血酸钠，1.25~1.75mM丙酮酸钠，0.0075~0.0125mM牛磺酸，1.75~2.25mM硫脲，6.5~8.5mM海藻糖，0.4~0.6mM犬尿酸，5~15μM 6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮，45~55μM DL-AP5，0.4~0.6μM河豚毒素和3.5-5.5 µg/ml放线菌素D；所述人工脑脊液的pH值为7.2~7.6。

本申请发明人通过大量的实验筛选，在人工脑脊液中加入了抑制剂混合物犬尿酸、放线菌素D、6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮、DL-AP5和河豚毒素，并对各组分的含量进行优选，使人工脑脊液能降低神经毒性，提高神经元的存活率，更适合灵长类动物脑细胞神经元的分离。

本发明还提供一种用于灵长类动物神经元分离的试剂盒，所述试剂盒包括：上述人工脑脊液和脑组织修复液。

本发明的试剂盒首次成功分离出灵长类动物单个神经元且能保证90%以上的神经元的存活，并能够保留神经元的胞体、树突、轴突和其他突起等。本发明的试剂盒能够实现灵长类单个神经元几乎所有信息的检测，更深入地了解不同神经元的异质性，探究神经元更全面更完整的信息。