[发明专利]一株发酵生产(2R,3R)-丁二醇和乙偶姻的枯草芽孢杆菌及其应用

说明书

本发明公开了一株发酵生产(2R,3R)‑丁二醇和乙偶姻的枯草芽孢杆菌及其应用，属于微生物及发酵工程技术领域。所述枯草芽孢杆菌BacillussubtilisM9保藏号为CGMCCNo.23179。以葡萄糖为碳源，利用菌株M9发酵生产高纯度(2R,3R)‑丁二醇和乙偶姻，不同的通气和搅拌条件下可获得以乙偶姻为主产物或(2R,3R)‑丁二醇主产物的乙偶姻和2,3‑丁二醇混合产物。在0.2vvm、170rpm条件下批式发酵58h，可获得75g/L乙偶姻和2,3‑丁二醇，(2R,3R)‑丁二醇浓度为62.1g/L，占2,3‑丁二醇总量的95％；批式补料发酵76h获得90g/L的乙偶姻和2,3‑丁二醇。菌株M9的产物分布具有很强的鲁棒性，可以通过调整供氧条件获得不同的产物组成以应对市场需求，而且发酵过程中供氧需求低于大部分枯草芽孢杆菌，降低了设备和运行费用，具有良好的产业化优势。

技术领域

本发明属于微生物及发酵工程技术领域，具体涉及一株发酵生产(2R,3R)-丁二醇和乙偶姻的枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术

2,3-丁二醇(英文名2,3-Butanediol，简称2,3-BD)存在三种光学异构体：(2R,3R)-BD、(2S,3S)-BD和(2R,3S)-BD即meso-2,3-BD。其中，(2R,3R)-BD的凝固点为-60℃，可做抗冻剂使用。乙偶姻(Acetoin,AC)，即3-羟基-2-丁酮，是一种广泛存在于自然界的天然香料，具有令人愉快的奶油香气。乙偶姻具有两种光学异构体，R-AC和S-AC。

自然界中产2,3-丁二醇和乙偶姻的菌种很多，属于生物安全菌且产量具有工业化前景的菌种主要是芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌。在微生物转化葡萄糖合成乙偶姻和2,3-BD时，乙偶姻是2,3-BD的前体，两者可通过2,3-BD脱氢酶的催化实现可逆转化。因此，微生物发酵生产乙偶姻或2,3-BD时，通常能检测到四种产物：(2R,3R)-BD、meso-2,3-BD、R-AC和S-AC，其中S-AC通常浓度偏低，其余三者的浓度取决于菌种本身的代谢特点以及发酵条件。不过，于微生物而言，2,3-BD是代谢的终产物，对微生物毒性很小，更有利于微生物的生存。

近年来发酵法生产(2R,3R)-BD和乙偶姻的研究主要集中于天然菌株的筛选及其改造，以葡萄糖为碳源，利用生物安全的天然菌株或基因工程改造菌株发酵(2R,3R)-BD或乙偶姻时，高产菌株的产物产量通常在60g/L以上。这些基因工程改造的菌种，产物基本以乙偶姻或(2R,3R)-BD为主，通过不同的菌株发酵获得不同的产物。虽然近几年也有一些通过发酵条件调控获得2,3-BD主产物或乙偶姻主产物的文献报道(Li et al,ProcessBiochemistry 2017,57:35-42；Xiao,et al,J Chem Technol Biotechnol 2017,92:2845-2852)，但总体而言这类具有产物分布鲁棒性特点的菌种较少。乙偶姻和2,3-BD沸点存在很大差异(148℃ vs 183～184℃)，通过精馏可将两者分离。利用这类具有产物分布鲁棒性特点的菌种发酵时，可通过调控发酵条件获得不同的产物组成以应对市场需求，因此这类菌种具有良好的产业化优势。

本课题组前期从大连海域海泥中筛选得到一株枯草芽孢杆菌DL01，产物以乙偶姻为主，耐高糖，以210g/L葡萄糖为碳源可生成76g/L乙偶姻，生产强度1.00g/(L·h)(Dai etal,Process Biochemistry 2015,50:1730-1734)。本发明中，通过诱变筛选获得一株突变株M9，主产(2R,3R)-丁二醇和乙偶姻，并且二者比例随供氧条件的变化而改变，具有显著的产物分布鲁棒性。

综上所述，目前产(2R,3R)-BD和乙偶姻的菌种中具有产物分布鲁棒性特点的菌种较少，获得产物浓度较高的此类生物安全菌株对于发酵法生产(2R,3R)-BD和乙偶姻的工业化具有重要意义。

发明内容

鉴于上述现有菌种的现状，本发明的目的在于提供一株产(2R,3R)-丁二醇和乙偶姻的生物安全菌株。