[发明专利]用于化学发光免疫检测的抗体检测液及外泌体检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于化学发光免疫检测的抗体检测液及外泌体检测试剂盒。所述抗体检测液包含亲和素、化学发光标记物标记的生物素、抗体标记的生物素，所述亲和素含有4个生物素结合位点，其中一个位点与抗体标记的生物素结合、其他三个位点与化学发光标记物标记的生物素结合，通过所述抗体与目标物免疫结合从而实现对目标物的化学发光检测。本发明提供的试剂盒是利用所述抗体检测液对外泌体进行检测的试剂盒，具体还包括磁珠悬液、发光激发液、标准品、稀释液、洗涤液。本发明利用链霉亲和素为四聚体分子的性质，使一个CD9抗体分子可以桥接三个吖啶酯分子，将发光信号扩大三倍，提高了试剂盒的灵敏度。

技术领域

本发明属于生物免疫检测技术领域，具体涉及一种用于化学发光免疫检测的抗体检测液及外泌体检测试剂盒。

背景技术

外泌体(exosome)是活细胞释放到细胞外的微小囊泡，直径在30-160nm。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，它们广泛存在于血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等体液中，被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯。研究表明，外泌体与免疫反应、病毒致病性、妊娠、心血管疾病、中枢神经系统相关疾病和癌症进展有关。外泌体具有细胞类似的拓扑结构，包含DNA，RNA，蛋白质，脂质和小分子代谢物等物质，这些蛋白，脂质，RNA，miRNA等组分可作为癌症诊断和预兆。通过对体液中外泌体的分离，使用组合的标志物反映疾病状态，可以增加疾病诊断的特异性和敏感性。外泌体膜表面具有标记物如CD9、CD63、CD81等，这些标记物有助于我们分离鉴定外泌体。

目前，市场上外泌体定量的试剂盒很少，且主要采用Westernblot、ELISA和流式细胞术的定量方法。

Westernblot的方法：将细胞裂解液与外泌体样本混合，按照4℃12000g离心力，离心5min，取上清，采用外泌体标志蛋白抗体杂交，杂交之后进行SDS-PAGE电泳分析。

ELISA的方法：外泌体被捕获于高蛋白结合的微量滴度板上，依次与外泌体标志性蛋白一抗和二抗孵育，辣根过氧化物酶连接的二抗用于信号扩增，使用底物进行显色，结果通过有特定波长吸光度的微量滴定板阅读器进行定量。

流式细胞术：使用外泌体特异性抗体包被的磁珠捕获外泌体，同时使用荧光素偶联的外泌体特异性抗体与外泌体结合，最后用流式细胞仪检测荧光信号，根据信号值定量外泌体。

当前的外泌体定量方法缺点如下：

Westernblot的方法：操作步骤繁琐、耗时长、灵敏度低且需要的样本量大，所用的个别试剂有毒，对操作人员身体和环境可能造成危害，只能对外泌体进行相对定量。

ELISA的方法：操作步骤繁琐、耗时长、灵敏度相对Western blot高，但信号值低，稳定性差，价格昂贵，不适合自动化操作。

流式细胞术：稳定性差，不仅试剂成本高，且需要昂贵的流式细胞仪，不利于常规实验室开展。

总而言之，不管采用哪种方法，外泌体定量一直存在灵敏度低，重复性差，价格昂贵等难题。

发明内容

本发明的目的是，提供一种用于化学发光免疫检测的抗体检测液及外泌体检测试剂盒，主要解决现有技术中外泌体检测灵敏度低，重复性差，成本高的技术问题。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

一种用于化学发光免疫检测的抗体检测液，所述抗体检测液包含亲和素、化学发光标记物标记的生物素、抗体标记的生物素，所述亲和素含有4个生物素结合位点，其中一个位点与抗体标记的生物素结合、其他三个位点与化学发光标记物标记的生物素结合，通过所述抗体与目标物免疫结合从而实现对目标物的化学发光检测。

作为优选实施方案，所述亲和素为链霉亲和素，所述化学发光标记物为吖啶酯。

本发明还提供所述的抗体检测液的制备方法，包括如下步骤：