[发明专利]一种重组载体CTE528及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种重组载体CTE528及其构建方法和应用，属于基因工程领域。本发明针对微藻转基因的研究大都集中在模式藻莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的缺点，提供了一种可在盐藻基因工程中高效使用的载体系统构建方法，先将CAT基因两侧添加NdeⅠ后，克隆至pBI221‑GFP载体上作为中间载体CTE527，再将Ubi和Omega拼接后，两侧添加Sse8387Ⅰ/BamHⅠ并克隆至CTE527中。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种重组载体CTE528及其制备方法和应用。

背景技术

巴夫杜氏藻(Dunaliella parva)是单细胞盐藻，可在含0.05-5M NaCl的培养基中正常生长，在户外大规模培养中抗污染能力较强。它具有如下优点：光合自养、抗逆性强及培养条件简单；无细胞壁，有利于遗传转化；富含β-胡萝卜素和甘油，营养价值较高。

在藻类转基因中，由于只有一小部分藻细胞转化成功，因此使用选择标记基因非常必要。选择标记基因通常是抗生素抗性基因，它们是一类显性标记，可以向实现转化的藻细胞提供一个新表型。此外，在植物基因工程中常用的启动子如CaMV35S/SV40等在微藻中的效果有限。目前，针对微藻转基因的研究大都集中在模式藻莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)，在其它微藻中的研究很少，限制了微藻基因工程的发展。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种重组载体CTE528，是将启动子UbiΩ(Ubi代表maize ubiquitin promoter，ID为CS584019.1，Ω序列的ID为AB369276)和CAT基因(ID为U57025.2)插入载体pBI221-GFP中而获得；

优选地，所述的启动子UbiΩ是插入至pBI221-GFP中的Sse8387Ⅰ位点和BamHⅠ双酶切位点之间，所述的CAT基因是插入至pBI221-GFP中的NdeⅠ单酶切位点间。

本发明的第二个目的在于提供一种构建重组载体CTE528的方法，包括以下步骤：

步骤一：将CAT基因两侧添加NdeⅠ后，克隆至pBI221-GFP载体上，获得中间载体CTE527；

步骤二：将Ub i和Omega拼接后，两侧分别添加Sse8387Ⅰ和BamHⅠ并克隆至CTE527中。

本发明的第二个目的在于提供本发明重组载体CTE528在基因工程中的应用。

优选地，所述的重组载体CTE528在盐藻(Dunaliella)基因工程中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：使用高效的UbiΩ启动子代替了植物基因工程常用的CaMV35S启动子；添加了盐藻敏感的抗生素氯霉素对应的选择标记基因CAT，便于高效筛选盐藻转化子。

附图说明

图1为CTE527template-1和CTE527template-2的扩增产物凝胶电泳图，其中M1:DL2000 DNA Marker；1:CTE527-PCR产物Ⅰ；2:CTE527-PCR产物Ⅱ。

图2为被酶切的质粒pBI221-GFP的扩增产物凝胶电泳图，其中M2：λ-HindⅢdigest；1：pBI221-GFP-plasmid；2：pBI221-GFP-NdeⅠ；M1：DL2000 DNA Marker。

图3为pGA1611-Ubil和pUC57-Q的扩增产物凝胶电泳图，其中M1：DL2000 DNAMarker；1：CTE528-PCR产物Ⅰ；2：CTE528-PCR产物Ⅱ。