[发明专利]LOC_Os10g22520基因及其在调控水稻低温萌发力中的应用

说明书

本发明公开了LOC_Os10g22520基因及其在调控水稻低温萌发力中的应用，属于水稻抗非生物胁迫领域。发明首次验证了水稻基因LOC_Os10g22520(如SEQ ID NO.1的35‑1567位碱基所示)是调控水稻低温萌发力的功能基因。实验证明过量表达LOC_Os10g22520能使不耐低温萌发材料的低温萌发力增强，因此可应用于水稻的基因遗传工程育种，并能够应用于生产实践中，调控水稻的低温萌发力，从而保障目前极端气候频发的条件下的直播稻生产安全。针对前述应用，本发明还提供了LOC_Os10g22520基因的过量表达载体pOX‑10g22520。

技术领域

本发明属于水稻抗非生物胁迫领域，具体涉及LOC_Os10g22520基因在调控水稻低温萌发力中的应用。

背景技术

水稻种子的萌发力(Germinability)对于水稻种植和生产具有重大影响。水稻种子的萌发除了需要水分外，还需要适宜的温度；温度越低，萌发时间越长。水稻最适宜的萌发温度是28-35℃，低于10℃(粳)或12℃(籼)将很难萌发。近年来快速发展的轻简化栽培技术直播稻，也要求品种在自然低温下有较高的萌发力，以保证直播成苗率和总产量。直播稻具有节本、省工、高效等优势，深受农民青睐；但目前受品种低温萌发力低的限制，其推广受到一定程度的制约。清楚地解析调控水稻低温萌发力的分子机制，并应用于分子辅助育种，将有利于促进直播稻的发展。

水稻低温萌发力(Low temperature germinability，LTG)是由微效多基因控制的复杂性状，目前已经鉴定到的相关QTL超过40个，但实现功能基因克隆的仅有3个，分别是位于3号染色体的qLTG3-1、位于7号染色体的OsSAP16和来自野生稻的LTG5。个别基因如qLTG3-1已经被成功应用于粳稻低温萌发力改良和标记辅助育种。而且有研究表明多个位点的聚合，会产生叠加效应。利用不同的遗传材料往往鉴定到不同位点的水稻低温萌发力QTL，因而同时存在于不同遗传背景的水稻低温萌发力QTL将具有极大的育种应用价值。实现更多水稻低温萌发力QTL的鉴定和克隆，进行精准的聚合、改良，将是提高水稻低温萌发力最有效的手段。

发明内容

本发明对来自56个国家和地区的375份稻种的低温萌发力进行了鉴定，结合700KSNP数据，利用全基因组关联分析鉴定到1个低温萌发力相关的主效QTL(qLTG_sRDP2-10a)，该位点与多个水稻低温萌发研究鉴定到的QTL共定位。该229kb的区间内注释有29个基因。通过不同表型材料的全基因组重测序和低温萌发转录组测序分析，锁定LOC_Os10g22484和LOC_Os10g22520作为该QTL位点的候选基因。本发明以耐低温萌发材料517种子萌发期的胚为样品，提取其总RNA，再将RNA反转录成cDNA，以该逆转录产物为模板设计引物进行PCR扩增。采用PCR产物直接纯化的方法回收目的片段。该目标片段和过量表达载体pOX用同源重组的方式进行连接，37℃反应半个小时，连接产物再转入大肠杆菌DH5α中，挑取阳性白色克隆，提取质粒，测序分析，该序列全长1533个碱基，其序列如SEQ ID NO.1所示，包含1个开放阅读框，即SEQ ID NO.1的35-1567位碱基所示，编码蛋白具有510个氨基酸残基，其序列如SEQ ID NO.2所示。由此构建LOC_Os10g22520的过量表达载体。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，把过量表达载体导入不耐低温萌发材料86中。转基因植株经PCR及定量PCR鉴定，证明目标基因已经转化到水稻中，并且实现目标基因的表达量提高。转基因阳性植株进行自交纯合，得到纯合阳性转基因株系。将同季收获的T₁代种子和野生型86的种子进行13℃低温萌发，10天后统计低温萌发率。结果显示，与野生型86相比，LOC_Os10g22520过表达株系的低温萌发力明显提高。这表明LOC_Os10g22520在水稻低温萌发力调控中发挥着作用。

本发明的第一个目的是提供调控水稻低温萌发力的基因LOC_Os10g22520，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的35-1567位碱基所示。

本发明的第二个目的是提供调控水稻低温萌发力的蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。