[发明专利]一种新型冠状病毒多肽高效偶联技术及其应用

权利要求书

1.一种新型冠状病毒多肽高效偶联技术，其特征在于：包括间接ELISA法，所述间接ELISA法包括以下操作步骤：

S1：采用间接ELISA法，血清样品中的SARS-CoV-2抗体与固定在ELISA板的SARS-CoV-2抗原物质结合，洗涤除去非结合的抗原及杂质，再加入酶标二抗。通过加入与酶反应的底物后显色，根据酶标仪OD450值可以判断样品中抗体的含量；

S2：相关试剂配制；

a1：封闭液，优选0.5％BSA的PBS液，0.22μm滤器过滤除菌，保存于4℃；

a2：洗涤液PBST，优选0.5％Tween20，PBS液，震荡混匀，室温保存；

a3：0.05mMCBBuffer，4.77gNa2CO3+8.82gNaHCO3，加入2L双蒸水充分搅拌；

a4：链霉亲和素包被酶标板，5μg/mL链霉亲和素加入微孔板，4℃孵育12h，取出微孔板，PBST液洗涤三次，加100μl/孔封闭液，置于37℃震荡孵育1h，随后用PBST液洗涤3次，即得到链霉亲和素包被的酶标板；

a5：辣根过氧化物酶HRP标记鼠抗人IgG单克隆抗体，HRP活化，称取2mgHRP溶解于500μl双蒸水，于上清液中加入0.5ml现配的0.06M过碘酸钠溶液，4℃避光反应30min；然后加入160MM的乙二醇溶液0.5ml，室温放置30min，上液中加2mg抗体，混匀后装入透析袋中，置于0.05mMCBBuffer中，4℃搅拌过夜透析，将透析后液体吸出至15ml离心管，加入0.2ml新配制的5mg/mlNaBH4，置于4℃2h，加入等量饱和硫酸铵溶液，混匀后置于4℃30min后，4℃、4000r离心20min，弃上清，将沉淀溶于PBS溶液中，装入透析袋，放入0.05mMCBBuffer透析液中，4℃搅拌过夜，中途更换透析液一次，透析完成后，将液体吸出，4℃、12000r离心20min，取上清和等量甘油混匀，-20℃保存，HRP单克隆抗体混合比例为1:1，可将HRP标记的鼠抗人IgG抗体进行一定倍数的稀释(100μl/孔)，37℃孵育30min，PBST洗涤5次。

2.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒多肽高效偶联技术，其特征在于：还包括磁微粒化学发光法，所述磁微粒化学发光法包括以下操作步骤：

T1：包被在磁微粒上的新型冠状病毒抗原与样本中的特异性IgG抗体结合，洗涤后加入吖啶酯标记的鼠抗人IgG抗体，形成免疫复合物，加入底物液，发生化学发光反应，产生的发光信号值与样本中特异性IgG抗体的含量呈正相关；

T2：相关试剂配制；

b1：链霉亲和素SA包被磁微粒，用4℃的MES溶液(0.1M，pH＝6.0)分别配制5mg/ml的EDC和NHS溶液，取10mg羧基修饰磁珠(所述的磁珠粒径为0.1-5μm)，分别加入等体积的上述EDC和NHS溶液，置于垂直旋转混匀仪上保持磁珠悬浮，37℃活化45min，磁分离器回收磁珠，PBS液(0.02mol/L，pH8.0)洗涤3次后重悬；取活化后的磁珠与适量链霉亲和素进行偶联，每1mg磁珠中添加100mgSA进行偶联，37℃活化1h，磁分离器回收磁珠；加入PBS(优选含1％的BSA)溶液重悬磁珠，37℃封闭45min(30min-1h)；PBS溶液洗涤磁珠3次，用PBST(含0.1％Tween20)保存缓冲液重悬，4℃保存；

b2：Biotin-RBD抗原的制备，同上述间接ELISA法步骤；

b3：Biotin-RBD抗原包被在SA磁微粒上，取100μlSA磁微粒悬浮液，加1mlBufferⅡ缓冲液重悬(PBSpH＝7.4，含0.05％的Tween-20，可根据需要添加0.01％～0.1％BSA)，磁吸附去上清；加1mlBufferⅡ稀释的Biotin-RBD抗原(使磁珠浓度为1mg/ml)，室温下旋转混匀反应60min，磁分离去上清，BufferⅡ洗涤3次；加适量BufferⅡ缓冲液，重悬至工作浓度，即得到Biotin-RBD抗原包被的SA磁微粒；

b4：吖啶酯标记鼠抗人IgG抗体的制备，采用0.02MPBS缓冲液对鼠抗人IgG抗体进行透析，吸取lmg透析后的鼠抗人IgG抗体于适当容器中，以PBS稀释；吖啶酯标记前先在无水N，N-二甲基甲酞胺中溶解成0.1～100mg/ml的吖啶酯母液，鼠抗人IgG抗体和吖啶酯母液按摩尔浓度1:100比例标记，立即涡旋混匀，避光条件下，室温置血液混匀仪上反应1h；加入l0mg/ml的赖氨酸溶液335μl，立即涡旋混匀，避光条件下，室温在血液混匀反应l0min；反应完成后过脱盐柱，得到吖啶酯标记的鼠抗人IgG抗体；采用方阵滴定法确定吖啶酯标记鼠抗人IgG抗体的最适工作浓度，用PBS进行稀释，混匀即可，置2-8℃存放。