[发明专利]石墨炔包裹四氧化三铁磁珠的免疫纳米材料及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种免疫石墨炔磁珠及其制备方法与应用。该免疫石墨炔磁珠为核壳结构，其核心为纳米磁珠，壳层为石墨炔层，在石墨炔层的表面修饰有单增李斯特菌抗体。本发明先制备得到以Fe₃O₄为核心的纳米材料；再将GDY‑Fe₃O₄用EDC和NHS处理，激活GDY表面的–COOH基团，最后GDY的–COOH与抗体的–NH₂相互作用，获得偶联抗体的Ab‑GDY‑Fe₃O₄免疫石墨炔磁珠。磁珠偶联抗体后的产品稳定性好，极大缩短细菌检测时间(2天)，捕获率(36.9％)和灵敏度高的优点，是一种新型细菌捕获和富集材料。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种病原微生物快速检测方法。

背景技术

单增李斯特菌广泛存在于土壤、水体、食品、人畜粪便中，是人畜共患病原，被称为“冰箱杀手”。我国部分地区调查结果显示食品中单增李斯特菌的污染率达到20％左右，单增李斯特菌感染散发病例也逐年递增，其易感人群为孕妇、新生儿、老人、HIV感染者及其他疾病引起的免疫低下人群，引起流产、菌血症及脑膜炎等一系列症状^[1,2]。在食品加工、储存、运输等环节均有单增李斯特菌污染的可能性，因此，需要建立有效的食源性致病菌检测体系，发展快速且准确的检测方法以完成对食品中单增李斯特菌的检测。

单增李斯特菌的传统检测方法是直接培养法。直接培养的方法的优点是可靠，稳定和敏感，并能够提供定性和定量数据，但是，此方法需要三到五天的时间来识别和分离细菌，并且假阴性的发生率相对较高^[3]。目前，用于单增李斯特菌检测的方法还有生化、血清学和分子生物学方法，如纸片法(即用平皿法)、酶联荧光分析法、金标免疫层析技术、流式细胞技术、核酸探针杂交技术、PCR检测技术等^[4]。PCR可以定量且相对灵敏，但食品中PCR反应抑制剂多糖等成分的存在，容易得到假阴性结果，需要其他方法辅助验证。免疫层析法不如直接培养法敏感，且不能定量。另外，还有商品化的偶联单增李斯特菌抗体的免疫磁珠，但就浓缩和捕获效率而言，该方法并不理想。因此，仍然需要开发更快，更灵敏，更简便的单增李斯特菌检测方法。

2010年中国科学院化学所李玉良等通过化学方法原位合成的石墨炔(GDY，Graphdiyne)是碳材料家族中又一个碳的同素异形体^[5]。石墨炔可以看作是石墨烯中1/3的C-C中插入两个C≡C(二炔或乙炔)键，该结构不仅有苯环，而且还有由苯环、C≡C键构成的18个碳原子的大三角形环。石墨炔sp和sp²杂化的电子结构和层状二维平面的结构特点，使得其具有丰富的化学键、大的共轭体系、宽面间距、多孔、优良的化学性能、热稳定性、半导体性能，以及力学、催化和磁学等性能，成为继富勒烯、碳纳米管、石墨烯之后，又一种新的全碳二维平面结构材料^[6]。当前，石墨炔在电子信息、能源转化和存储以及生物医学等领域取得了许多重大进展^[7]。

报道显示，石墨炔材料在病原菌方面的应用包括两方面：(1)杀菌作用：以H₂O₂/H₂SO₄为氧化剂通过表面氧化合成的氧化石墨炔，表面亲水性大大增强。在与细菌直接接触过程中，产生大量活性氧，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有很好的杀菌作用；石墨炔修饰的TiO₂纳米纤维能增强光催化作用，延长抗菌能力，可防止植入物感染。同时这种纳米材料还有很好的生物相容性和骨诱导能力，可促进细胞黏附、分化和骨组织再生^[8]。(2)生物检测器：石墨炔纳米片可有效淬灭单链DNA的荧光活性，用于结合分枝杆菌的微量检测^[9]；包裹氧化石墨炔、氧化石墨烯、黑磷(black phosphorous)的二维纳米Janus微电机吸附罗丹明标记的亲和肽，可结合霍乱弧菌和副溶血弧菌中的霍乱毒素B，提高细菌的检测灵敏度^[10]。