[发明专利]芋球茎发育过程中内参基因筛选及其应用

说明书

本发明涉及植物基因技术领域，特别涉及芋球茎发育过程中内参基因筛选及其应用，本发明对芋球茎发育期的样本进行RNA‑Seq测序，筛选表达量中等、稳定的基因作为候选内参基因，利用软件评估并分析各个候选内参基因在球茎的整个发育阶段的表达稳定性，并利用目的基因验证，最终筛选出比常用的管家基因更为稳定的内参基因gene‑Taro_030192，最大程度地减小了由于内参基因的选择造成样品之间和样品内部的差异，为后期利用q RT‑PCR探索芋球茎发育相关关键基因奠定了坚实的基础。

【技术领域】

本发明涉及植物基因技术领域，特别涉及芋球茎发育过程中内参基因筛选及其应用。

【背景技术】

芋(Colocasia esculenta)又称芋头、芋艿、毛芋，是天南星科芋属的多年生草本植物。芋最初产于东南亚，之后向东传播到远东亚洲和大洋洲，向西传播到地中海地区，目前在全球范围内广泛种植，是很多非洲和亚洲太平洋岛国居民的主要粮食，与其它块茎和块根植物相比，芋具有更高的营养价值。芋球茎的碳水化合物含量几乎是马铃薯的两倍，蛋白质含量也比山药、木薯、红薯高11％，由于存在如此丰富的营养物质含量，了解这些营养物质组成的遗传基础很重要。

但是目前对该作物的研究不多，近年来，随着高通量测序和分子生物学研究的不断发展，基因的表达分析也逐渐应用于揭示芋基因表达和调控机理的研究。随着芋基因组的测序，更加加快了芋相关性状的遗传机理解析。

实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)是目前检测基因表达水平的主要分析手段。qRT-PCR结果的可靠性受到初始样本量、RNA完整性、cDNA质量和扩增效率等因素的影响。因此，表达稳定的内参基因对比较不同样本目的基因表达水平至关重要，正确选择合适的内参基因进行校正和标准化，才能获得准确的qRT-PCR结果。目前，植物中常用来作为内参基因的基因有肌动蛋白(actin)、微管蛋白基因(β-tubulin,TUB)、转录延伸因子基因(elongation factor,EF1A和EF1B)、真核起始因子(eukaryotic initiationfactor,eIF)、泛素结合酶基因(ubiquitin-conjugating enzyme,UBC)、组蛋白(Histone,H3-1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)等。但是随着研究的深入，以往认为的很多内参基因(如actin等)在一定的实验条件下其表达量并不稳定。因此，在实际研究中，需要针对样本的不同组织或者不同生长发育时间段进行取材来筛选出稳定表达的内参基因。

本申请基于课题组前期对芋球茎不同发育阶段的样本进行转录本测序的数据，利用qRT-PCR分析候选基因在芋球茎8组不同发育时期表达稳定性，利用三种内参基因稳定性分析软件geNorm、NormFinder和BestKeeper分析候选内参基因在不同发育时期的稳定性并进行综合分析排序，为今后能更好开展芋球茎发育相关功能基因表达研究提供了参考依据。

【发明内容】

鉴于上述内容，有必要挖掘芋的内参基因，可以很好的对芋的表达分析提供重要参考。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

芋内参基因gene-Taro_030192，所述内参基因gene-Taro_030192的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述引物对其上游序列如序列表SEQ ID NO.2所示，下游序列如序列表SEQ ID NO.3所示。

本发明还包括所述的芋内参基因gene-Taro_030192在芋球茎发育不同时期进行荧光定量表达分析的应用。

进一步的，所述芋球茎发育不同时期分别为：播种后30d、60d、90d、120d、150d、180d、210d、240d的球茎。