[发明专利]一种利用基因工程修饰的滋养细胞的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种利用基因工程修饰的滋养细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)pLV-mbIL-21-OX40L-CD48慢病毒载体质粒的构建；

(2)采用pLV-mbIL-21-OX40L-CD48慢病毒载体质粒制备重组慢病毒；

(3)提取重组慢病毒，感染k562细胞，分选后进行亚克隆，灭菌后得到K562-ZHX滋养细胞。

2.根据权利要求1所述的一种利用基因工程修饰的滋养细胞的制备方法，其特征在于：步骤(1)具体为：

S1：获取人IL-21、人OX40L、人CD48的基因编码序列；

S2：将人IL-21基因编码序列、PGK启动子编码序列、人OX40L基因编码序列、T2A自我剪切肽编码序列、CD48基因编码序列依次串联，得mbIL-21-PGK-OX40L-T2A-CD48基因序列；其中mbIL-21-PGK-OX40L-T2A-CD48基因序列如SEQ ID NO.6所示；

S3：将mbIL-21-PGK-OX40L-T2A-CD48基因序列构建至质粒载体中，得到pLV-mbIL-21-OX40L-CD48慢病毒载体质粒。

3.根据权利要求2所述的一种利用基因工程修饰的滋养细胞的制备方法，其特征在于：步骤S1中，人IL-21的基因编码序列如SEQ ID NO.1所示，人OX40L的基因编码序列如SEQ IDNO.2所示，人CD48的基因编码序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求2所述的一种利用基因工程修饰的滋养细胞的制备方法，其特征在于：步骤S3具体为：

S31：将mbIL-21-PGK-OX40L-T2A-CD48基因序列进行BamH I、Xmal I双酶切，并电泳回收；

S32：将慢病毒转移质粒pLV-EF1a-IRES-Puro进行BamH I、Xmal I双酶切，并电泳回收线性化骨架质粒；

S33：将酶切后的mbIL-21-PGK-OX40L-T2A-CD48基因通过Ligation High Ver2连接酶连接到酶切后的pLV-EF1a-IRES-Puro骨架质粒上，其转化到感受态E.coli(DH5α)细胞上，纯化，制得pLV-mbIL-21-OX40L-CD48慢病毒载体质粒。

5.根据权利要求1所述的一种利用基因工程修饰的滋养细胞的制备方法，其特征在于：步骤(2)具体为：

S4：重组慢病毒的制备：

S41：将293T细胞接种于含有DMEM完全培养液的培养板中，在37℃，5％CO₂条件下孵育，得到含有293T细胞的培养板；

S42：第二天，将pLV-mbIL-21-OX40L-CD48慢病毒载体质粒、psPAX-1质粒、pMD2.G质粒混合，Opti-MEM培养基稀释至1μg/μL，得到稀释液；

取A管，向其中加入无血清Opti-MEM培养基、转染试剂，涡旋混匀10s，得到A液；

取B管，向其中加入无血清Opti-MEM培养基、稀释液、P3000试剂，涡旋10s，得到B液；

将A液、B液充分混匀，室温孵育15min，滴加至含有293T细胞的培养板中，置于37℃，5％CO₂条件下孵育6-8小时，弃掉培养板中的培养液，补充加入DMEM完全培养液，在37℃，5％CO₂条件下继续孵育；

S43：培养24小时后，收集第一批细胞上清；

补充加入DMEM完全培养液,，在37℃，5％CO₂条件下继续孵育；

S44：培养52小时后，收集第二批细胞上清，与第一批细胞上清混合后离心，收集并转移上清液；

S5：浓缩上清液，得到重组慢病毒。