[发明专利]山核桃原生质体的制备及瞬时转化体系的建立

权利要求书

1.一种临安山核桃原生质体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤(1)、选择生长状态良好，黄色新鲜脆嫩的临安山核桃愈伤组织磨碎；

步骤(2)、将研磨好的临安山核桃愈伤组织置于酶解液中，25℃避光条件，在50～65rpm/min的摇床上酶解4.5～5.5h；

所述酶解液包括以下组分：Cellulase R10 3-3.5％(wt/vol)、Macerozyme R10 0.7-1％(wt/vol)、Driselase 0.3-0.5％(wt/vol)、D-甘露醇0.4M、KCl 40mM、MES(PH 5.7)40mM、CaCl₂10mM、BSA0.1％(wt/vol)；

步骤(3)、酶解产物过滤，滤液低速离心取沉淀；在沉淀中加入预冷W5溶液轻柔洗涤沉淀，终止酶解，低速离心取沉淀，重复2次，将酶解液去除干净；

步骤(4)、在沉淀中再次加入预冷W5溶液轻柔洗涤沉淀，冰浴30min后低速离心取沉淀；用MMG溶液重悬，获得纯化后的原生质体。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于临安山核桃愈伤组织采用在继代后的7d内。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)预冷W5溶液与沉淀的体积比为2:1；步骤(4)预冷W5溶液与沉淀的体积比为1:1。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述W5溶液包括以下组分：NaCl 154mM、CaCl₂125mM、KCl 5mM、MES 2mM；所述MMG溶液包括以下组分：D-甘露醇0.4mM、MgCl2 15mM、MES4mM。

5.PEG-Ca²⁺介导临安山核桃原生质体瞬时转化方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤(1)、将待转化的外源基因DNA、100ul用MMG溶液重悬后的权利要求1-4任一所述的方法制备得到的临安山核桃原生质体、PEG-Ca2+溶液轻柔混匀，25℃避光条件20-25min，得的孵育转化后混合物；外源基因DNA与原生质体的质量体积比为5-15μg：100ul；PEG-Ca2+溶液与外源基因DNA和原生质体总量的体积比为1:1；

步骤(2)、孵育转化后混合物加入等体积W5溶液，终止转化，低速离心取沉淀；

步骤(3)、沉淀中加入1000ul W5溶液，轻柔混匀，25℃避光条件培养过夜。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于待转化的外源基因DNA的浓度为3000ng/ul。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述PEG-Ca²⁺溶液包括D-甘露醇0.5M、CaCl₂1M、PEG4000 40％(wt/vol)。

8.一种美国山核桃原生质体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤(1)、选择生长状态良好的美国山核桃愈伤组织，用洁净的手术刀将其切碎；

步骤(2)、将切碎的美国山核桃愈伤组织置于酶解液中，25℃避光条件，在65rpm/min的摇床上酶解4～4.5h；

所述的酶解液包括以下组分：纤维素酶RS 1.0-1.5％(wt/vol)、离析酶R10 0.7-1.0％(wt/vol)、果胶酶0.5-0.8％(wt/vol)、D-甘露醇0.7M、KCl 40mM、MES(PH 5.7)40mM、CaCl₂10mM、BSA 0.1％(wt/vol)；

步骤(3)、酶解产物过滤，滤液低速离心取沉淀；在沉淀中加入等体积预冷W5溶液轻柔洗涤沉淀，终止酶解，低速离心取沉淀；

步骤(4)、在沉淀中再次加入等体积预冷W5溶液轻柔洗涤沉淀，冰浴30min后低速离心取沉淀；用MMG溶液重悬，获得纯化后的原生质体。